Hsp90（熱休克蛋白90）是一種在真核細胞中廣泛存在的分子伴侶，與20多種cochaperones（輔助蛋白）合作，負責(zé)數(shù)百種客戶蛋白的成熟過程。盡管Hsp90已經(jīng)被研究了數(shù)十年，但其功能復(fù)合體的組成成分以及ATP水解能量如何被利用以實現(xiàn)循環(huán)操作仍然不甚清楚。本研究通過單分子FRET技術(shù)，展示了輔助蛋白如何引入Hsp90在與激酶Ste11相互作用過程中的構(gòu)象變化的方向性。研究發(fā)現(xiàn)，三個輔助蛋白是將ATP水解與構(gòu)象變化耦合所必需的，這對于功能性循環(huán)操作至關(guān)重要。

研究者們使用了單分子F?rster共振能量轉(zhuǎn)移（smFRET）技術(shù)來觀察Hsp90與客戶激酶Ste11相互作用過程中的構(gòu)象變化。通過測量FRET效率，可以區(qū)分Hsp90的開放和閉合構(gòu)象。此外，研究者們還開發(fā)了一種測試程序，使用外部激光觸發(fā)來在實驗數(shù)據(jù)中創(chuàng)建人工方向性，以驗證單分子實驗中方向性的檢測和分析能力。

實驗

實驗中，研究者們首先驗證了他們的數(shù)據(jù)分析方法SMACKS和Hidden-Markury在模擬數(shù)據(jù)上的表現(xiàn)，這些模擬數(shù)據(jù)包含了不同方向性（ΔG值）的系統(tǒng)。接著，他們將這些方法應(yīng)用于Hsp90復(fù)合體的實驗數(shù)據(jù)，分析了在不同條件下Hsp90的動力學(xué)行為，包括在有無輔助蛋白和客戶激酶存在時的情況。實驗結(jié)果顯示，只有當(dāng)所有三個輔助蛋白（Aha1、Sba1和Cdc37）以及客戶激酶Ste11存在時，Hsp90的動力學(xué)行為才表現(xiàn)出明顯的方向性。

結(jié)論

得出結(jié)論，Hsp90的功能循環(huán)操作需要三個輔助蛋白的參與，以將ATP水解的能量傳遞給Hsp90的構(gòu)象變化。這種方向性的變化是激酶成熟過程中能量效率最高的途徑。此外，研究還發(fā)現(xiàn)Hsp90的ATPase活性與方向性只有微弱的聯(lián)系，表明Hsp90的構(gòu)象狀態(tài)與ATP水解并不緊密相關(guān)。

RAPP Polymere的methoxy-polyethylene glycol–silane(Cat# 125000-71)的作用和價值:

在本研究中，Rapp Polymere品牌的methoxy-polyethylene glycol–silane（MPEG-Si）起到了重要的作用。MPEG-Si是一種用于表面改性的化合物，它在實驗中被用來防止非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合到測量室的表面上。這對于單分子測量至關(guān)重要，因為非特異性結(jié)合可能會干擾實驗結(jié)果，導(dǎo)致數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。

MPEG-Si的價值在于其能夠創(chuàng)建一個抗非特異性吸附的表面，這對于提高實驗的特異性和可重復(fù)性至關(guān)重要。在實驗中，MPEG-Si與silane-PEG-Biotin混合使用，以增強對測量室表面的被動化處理。這種處理不僅減少了背景信號，還確保了只有生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)能夠通過biotin-Neutravidin結(jié)合到室表面，從而允許對單個蛋白質(zhì)分子的行為進行精確測量。

通過使用Rapp Polymere品牌的MPEG-Si，研究者們能夠確保實驗條件的穩(wěn)定性和可靠性，這對于揭示Hsp90與輔助蛋白相互作用的復(fù)雜動態(tài)至關(guān)重要。MPEG-Si的使用提高了實驗的信噪比，使得研究者能夠更清晰地觀察到Hsp90的構(gòu)象變化和方向性行為，從而為理解Hsp90的功能機制提供了重要的實驗數(shù)據(jù)。

總的來說，Rapp Polymere品牌的MPEG-Si在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，它不僅提高了實驗的準(zhǔn)確性，還為深入理解Hsp90的功能和調(diào)控機制提供了堅實的基礎(chǔ)。這種化合物的應(yīng)用展示了在生物物理和分子生物學(xué)研究中，表面化學(xué)的重要性以及如何通過精確控制實驗條件來獲得高質(zhì)量的科學(xué)數(shù)據(jù)。