JPT將重疊肽段沿著目標(biāo)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行排列，以實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞刺激的最優(yōu)化，同時(shí)盡量減少遺漏T細(xì)胞表位的可能性。您可以使用PepMix肽段混合物來替代蛋白（例如重組蛋白）或病原體裂解物，用于抗原特異性T細(xì)胞的刺激。與蛋白抗原相比，PepMix肽段混合物能夠提供更有效的刺激，因?yàn)樗鼈儾恍枰ㄟ^抗原呈遞的外源途徑進(jìn)行處理。PepMix肽池在全球范圍內(nèi)被廣泛用于基礎(chǔ)和臨床研究的各種目的，例如抗原特異性T細(xì)胞的檢測(cè)、計(jì)數(shù)和功能分析，增殖研究以及T細(xì)胞擴(kuò)增等。

提供的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（ICS）和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISpot）實(shí)驗(yàn)方案詳細(xì)說明了在外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）懸液中刺激T細(xì)胞的方法。PBMCs可以通過密度梯度離心從抗凝（最好使用肝素抗凝）的全血中新鮮制備。這些實(shí)驗(yàn)方案僅作為使用PepMix的示例，如果使用全血或包含其他來源T細(xì)胞的懸液，則需要對(duì)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行調(diào)整。

PepMix肽池

一般情況下，PepMix肽池包含15個(gè)氨基酸長度的肽段，覆蓋所指示蛋白的完整序列，且相鄰肽段之間有11個(gè)氨基酸的重疊。每瓶含有每種肽段25微克（約15納摩爾），足以刺激多達(dá)2.5×10?個(gè)細(xì)胞。每種肽段均為化學(xué)合成、純化，并在加入PepMix之前通過液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）進(jìn)行分析。

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISpot）和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（ICS）實(shí)驗(yàn)方案

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISpot）實(shí)驗(yàn)：本方案是為外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）的刺激而設(shè)計(jì)的。如果用于其他材料，可能需要進(jìn)行調(diào)整。PBMCs可以從全血或白細(xì)胞層分離得到。或者，也可以使用凍存的PBMC樣本。在這種情況下，設(shè)置一個(gè)讓細(xì)胞恢復(fù)的靜置步驟可能是有用的。

1. 向包被有捕獲抗體的ELISpot板的每個(gè)孔中加入100微升含有10萬到30萬個(gè)細(xì)胞（1-3×10?細(xì)胞/毫升）的細(xì)胞懸液。此外，向每個(gè)孔中加入100微升刺激液（最終濃度加倍）。

2. 將板置于37℃、5% CO?的濕化培養(yǎng)箱中孵育至少16小時(shí)，以刺激細(xì)胞。

3. 多次洗滌板以去除附著的細(xì)胞。

4. 向孔中加入您選擇的合適檢測(cè)抗體，使其達(dá)到期望的濃度（例如1微克/毫升）。

5. 在濕化培養(yǎng)箱（37℃，5% CO?）中孵育2小時(shí)。

6. 多次洗板。

7. 如果使用生物素標(biāo)記的抗體，在此步驟加入鏈霉親和素偶聯(lián)的酶，并在室溫下于暗處孵育1小時(shí)。

8. 多次洗板。

9. 向孔中加入100微升適當(dāng)?shù)牡孜铮却唿c(diǎn)顯色（通常在3-7分鐘后）。

10. 用自來水沖洗孔以終止反應(yīng)。

11. ELISpot板在分析前應(yīng)晾干。

12. 最好使用ELISpot讀板儀計(jì)數(shù)斑點(diǎn)。

細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（ICS）實(shí)驗(yàn)：在標(biāo)準(zhǔn)的96孔圓底板中，適合用于PBMC刺激的總體積為200微升。例如，您可以在該體積中刺激20萬到50萬（0.2×10⁶到0.5×10⁶）個(gè)細(xì)胞。我們建議將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×10⁶個(gè)細(xì)胞/毫升，以便在100微升細(xì)胞懸液中分裝20萬（0.2×10⁶）個(gè)細(xì)胞。

將細(xì)胞制備調(diào)整為2×10⁶個(gè)細(xì)胞/毫升，使用合適的檢測(cè)培養(yǎng)基，例如1640 RPMI培養(yǎng)基，其中含有2 mmol/L L-谷氨酰胺、5%（體積比）人AB型男性血清、1% MEM非必需氨基酸溶液（100倍濃縮）和1 mM丙酮酸鈉溶液（100 mM）。短期刺激可能不需要添加抗生素。從PepMix儲(chǔ)備液中在檢測(cè)培養(yǎng)基中制備雙倍濃度的PepMix溶液，并補(bǔ)充20 ug/ml布雷菲德菌素A（雙倍工作濃度）。

1. 向無菌96孔板的每個(gè)孔中加入100微升含有20微克/毫升布雷菲德菌素A（雙倍工作濃度）的肽溶液。對(duì)于未刺激對(duì)照組，將100微升含有相應(yīng)量DMSO和布雷菲德菌素A的檢測(cè)培養(yǎng)基加入孔中。每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件以及陽性和陰性對(duì)照組至少準(zhǔn)備兩個(gè)重復(fù)孔（兩個(gè)孔）。  

**注意**：如果同時(shí)使用另一種刺激物（例如蛋白、細(xì)菌或病毒裂解物）進(jìn)行平行刺激，而這些刺激物需要細(xì)胞內(nèi)蛋白處理，從而需要延遲中斷蛋白向高爾基體的運(yùn)輸以阻斷細(xì)胞因子分泌，那么可以在加入肽2小時(shí)后再向細(xì)胞中加入布雷菲德菌素A。  

2. 向每個(gè)孔中加入100微升含有20萬個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液。  

3. 蓋上板蓋，將板置于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO₂飽和水汽環(huán)境）中進(jìn)行細(xì)胞刺激。根據(jù)您的科學(xué)問題，細(xì)胞可以刺激6到16小時(shí)。  

4. 刺激完成后，將板以300×g、4℃離心6分鐘。小心地通過輕柔但有力地晃動(dòng)板來丟棄上清液。  

5. 用含有0.5%（重量/體積）牛血清白蛋白的200微升PBS重懸細(xì)胞沉淀。  

6. 再次離心板，并按照步驟4所述丟棄上清液。  

7. 在50微升的最終體積中進(jìn)行表面染色，用于免疫表型分析，4℃黑暗中孵育20分鐘。至少使用針對(duì)CD3、CD4和CD8的抗體來區(qū)分細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和T輔助細(xì)胞。這些抗體應(yīng)適用于隨后的固定和通透處理程序。通過抗體滴定驗(yàn)證必要的抗體濃度。  

8. 染色后，加入含有0.5%（重量/體積）牛血清白蛋白的150微升PBS，并將板以300×g、4℃離心6分鐘。小心地通過輕柔但有力地晃動(dòng)板來丟棄上清液。  

9. 用含有0.5%（重量/體積）牛血清白蛋白的200微升PBS重懸細(xì)胞沉淀。  

10. 再次離心板，并按照步驟8所述丟棄上清液。  

11. 用含有甲醇和皂甙的固定緩沖液（例如每孔50微升BD Cytofix/Cytoperm）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理，用于細(xì)胞內(nèi)染色，4℃黑暗中孵育20分鐘。  

12. 每孔加入150微升維持細(xì)胞通透狀態(tài)的洗滌緩沖液（例如BD Perm/Wash緩沖液），并將板以300×g、4℃離心6分鐘。小心地通過輕柔但有力地晃動(dòng)板來丟棄上清液。  

13. 用200微升洗滌緩沖液重懸細(xì)胞沉淀。  

14. 再次離心板，并按照步驟12所述丟棄上清液。  

15. 將適合您感興趣的細(xì)胞因子的細(xì)胞內(nèi)染色抗體稀釋在洗滌緩沖液中，每孔加入50微升混合液。充分混勻，但避免因緩沖液中的皂甙而產(chǎn)生泡沫。4℃黑暗中孵育30分鐘。  

16. 細(xì)胞內(nèi)染色完成后，每孔加入150微升洗滌緩沖液，并將板以300×g、4℃離心6分鐘。小心地丟棄上清液。  

17. 用流式細(xì)胞術(shù)緩沖液（例如含有0.5%（重量/體積）牛血清白蛋白的Dulbecco改良磷酸鹽緩沖液（D-PBS））重懸細(xì)胞沉淀。  

18. 再次離心板，并按照步驟16所述丟棄上清液。  

19. 用100微升流式細(xì)胞術(shù)緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，并根據(jù)您的儀器進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

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