在癌癥免疫療法領(lǐng)域，免疫檢查點(diǎn)阻斷療法（Checkpoint Blockade Therapy）已成為一種具有顯著臨床效益的治療手段，尤其是對(duì)于多種惡性腫瘤患者。該療法通過(guò)靶向細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（CTLA-4）和程序性死亡受體-1（PD-1）等免疫調(diào)節(jié)受體，能夠重新激活被腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制所抑制的T細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的有效控制。然而，關(guān)于這類(lèi)療法所激活的T細(xì)胞所針對(duì)的腫瘤抗原的具體身份，以及這些抗原是否能被用于開(kāi)發(fā)高度腫瘤特異性的疫苗，目前尚知之甚少。

在一項(xiàng)研究中，華盛頓大學(xué)的研究人員在《Nature》雜志上發(fā)表了名為“ Checkpoint Blockade Cancer Immunotherapy Targets TumourSpecific Mutant Antigens”的文章。文章旨在通過(guò)基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法，鑒定在接受αPD-1和/或αCTLA-4治療的、攜帶進(jìn)行性生長(zhǎng)肉瘤的小鼠模型中，腫瘤特異性突變抗原（TSMA）作為T(mén)細(xì)胞排斥抗原的角色。研究進(jìn)一步探索了基于這些突變表位的合成長(zhǎng)肽（SLP）疫苗，在誘導(dǎo)腫瘤排斥方面的效果，以及其與檢查點(diǎn)阻斷免疫療法的比較。

研究方法

1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c腫瘤移植

實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停貉芯渴褂昧藘煞N不同的進(jìn)行性MCA肉瘤細(xì)胞系（d42m1-T3和F244），并將這些細(xì)胞系移植到野生型（WT）小鼠體內(nèi)。

治療與評(píng)估：小鼠接受αPD-1和/或αCTLA-4的治療，并評(píng)估腫瘤的生長(zhǎng)和排斥情況。通過(guò)注射耗竭CD4+或CD8+細(xì)胞的抗體或中和IFN-γ的抗體來(lái)確認(rèn)免疫排斥的機(jī)制。

2. MHC I類(lèi)表位預(yù)測(cè)

基因突變分析：通過(guò)cDNA捕獲測(cè)序鑒定d42m1-T3細(xì)胞系中的非同義突變，并將這些突變轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列。

表位預(yù)測(cè)算法：使用三種MHC I類(lèi)表位結(jié)合算法（穩(wěn)定矩陣法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法和NetMHCpan算法）預(yù)測(cè)表位加工和結(jié)合親和力，計(jì)算每個(gè)預(yù)測(cè)表位的中位結(jié)合親和力。表位篩選：應(yīng)用過(guò)濾條件，包括去除預(yù)測(cè)加工不良的表位、來(lái)自假設(shè)蛋白的表位以及與其對(duì)應(yīng)野生型序列相比結(jié)合親和力較低的表位。

3. 腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）的分析

四聚體染色：使用加載有預(yù)測(cè)突變表位的H-2K^b或H-2D^b四聚體染色新鮮分離的CD8+ TILs，以鑒定特異性T細(xì)胞。

細(xì)胞因子檢測(cè)：通過(guò)ELISPOT和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測(cè)IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生，以評(píng)估T細(xì)胞的活性。

4. 疫苗實(shí)驗(yàn)

疫苗制備：合成包含突變表位的長(zhǎng)肽（SLP），并與聚肌胞苷酸（poly I:C）一起作為疫苗。

疫苗接種：將疫苗注射到已建立腫瘤的小鼠體內(nèi)，評(píng)估腫瘤排斥和生存情況。

5. RNA測(cè)序與基因表達(dá)分析

RNA提取與測(cè)序：從經(jīng)過(guò)不同檢查點(diǎn)阻斷治療的小鼠的mLama4特異性CD8+ TILs中提取RNA，并進(jìn)行RNA測(cè)序。

基因表達(dá)分析：使用DESeq2 R包分析差異表達(dá)的基因，并進(jìn)行基因集富集分析（GSEA），以揭示不同治療途徑中受調(diào)節(jié)的通路。

研究結(jié)果

1. 檢查點(diǎn)阻斷免疫治療誘導(dǎo)腫瘤排斥

腫瘤排斥：d42m1-T3和F244肉瘤細(xì)胞系在接受αPD-1和/或αCTLA-4治療的野生型小鼠體內(nèi)被排斥。排斥是免疫性的，因?yàn)樗梢酝ㄟ^(guò)耗竭CD4+或CD8+細(xì)胞或中和IFN-γ來(lái)消除，并且在缺乏T、B和NKT細(xì)胞的Rag2-/-小鼠或缺乏CD8α+/CD103+樹(shù)突狀細(xì)胞的Batf3-/-小鼠中不發(fā)生。

免疫檢查點(diǎn)阻斷治療后，d42m1-T3的排斥需要先天和適應(yīng)性免疫組分的參與：a. Rag2?/?、Batf3?/?或野生型小鼠隊(duì)列分別接受對(duì)照單克隆抗體（mAb）、αCD4、αCD8α或αIFN-γ單克隆抗體處理，隨后皮下注射1×10⁶個(gè)d42m1-T3腫瘤細(xì)胞，并在移植后第3、6和9天接受αCTLA-4治療。b、c. d42m1-T3（b）或F244（c）腫瘤細(xì)胞皮下注射到野生型小鼠（n=5）中，隨后在移植后第3、6和9天接受αPD-1治療。在腫瘤被排斥50天后，小鼠再次接受d42m1-T3或F244腫瘤細(xì)胞的挑戰(zhàn)。

2. 突變表位鑒定

表位預(yù)測(cè)與驗(yàn)證：通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了d42m1-T3細(xì)胞系中多個(gè)潛在的MHC I類(lèi)結(jié)合表位，并通過(guò)四聚體染色和細(xì)胞因子檢測(cè)驗(yàn)證了其中兩個(gè)主要的表位：mLama4和mAlg8。

質(zhì)譜驗(yàn)證：使用發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜（MS）和靶向選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）MS方法在d42m1-T3腫瘤細(xì)胞的H-2K^b洗脫物中檢測(cè)到了mLama4和mAlg8表位。

3. 疫苗的有效性

腫瘤排斥與生存：與接受無(wú)關(guān)HPV長(zhǎng)肽疫苗或僅接受poly I:C的小鼠相比，接種了包含mLama4和mAlg8表位的長(zhǎng)肽疫苗的小鼠在建立腫瘤后顯示出顯著的腫瘤排斥和生存益處。

預(yù)防性疫苗接種：預(yù)防性接種mLama4和mAlg8長(zhǎng)肽疫苗的小鼠在接種腫瘤細(xì)胞后顯示出更高的生存率。

4. 基因表達(dá)與通路分析

基因表達(dá)變化：不同檢查點(diǎn)阻斷治療對(duì)mLama4特異性CD8+ TILs的基因表達(dá)產(chǎn)生了大多治療特異性的改變，涉及CD8+ T細(xì)胞效應(yīng)功能的不同基因集。

通路分析：GSEA揭示了不同治療途徑中受調(diào)節(jié)的通路，包括效應(yīng)功能、MAPK、趨化因子和細(xì)胞因子受體信號(hào)通路以及代謝和IL-2信號(hào)通路等。

5. 功能表型的變化

制性受體表達(dá)：經(jīng)過(guò)αPD-1和/或αCTLA-4治療的小鼠的mLama4或mAlg8特異性CD8+ TILs顯示出較低的淋巴細(xì)胞激活基因3（LAG-3）和T細(xì)胞免疫球蛋白和粘蛋白蛋白3（TIM-3）表達(dá)。

細(xì)胞因子產(chǎn)生：治療后的TILs顯示出增強(qiáng)的IFN-γ和TNF-α產(chǎn)生，特別是接受αCTLA-4或αCTLA-4+αPD-1組合治療的小鼠。

IFN-γ ELISPOT分析mLama4或malg8 SLP加polyI:C免疫小鼠的肽刺激脾細(xì)胞（每組n=3只小鼠）

在免疫檢查點(diǎn)阻斷研究期間，研究者多次使用mabtech IFN-γ ELISpot檢測(cè)來(lái)表征抗原特異性T細(xì)胞在接受抗CTLA-4治療前后的功能。根據(jù)種屬，板子類(lèi)型，酶標(biāo)物等因素的不同，mabtech可提供多種IFN-γ ELISpot試劑盒以滿(mǎn)足不同客戶(hù)的需求：