為了誘導(dǎo)記憶B細(xì)胞分泌可檢測量的抗體，需要進(jìn)行多克隆激活。Mabtech經(jīng)過廣泛的研究和測試，嘗試了各種不同的激活組合，最終發(fā)現(xiàn)Toll樣受體7/8激動劑R848與重組IL-2的組合非常適合這一目的。這種組合能夠高效地激活記憶B細(xì)胞，使其分泌可檢測的抗體。因此，Mabtech開發(fā)了專門用于記憶B細(xì)胞的激活試劑，以幫助您在ELISpot和FluoroSpot實(shí)驗(yàn)中獲得最佳結(jié)果。

R848和IL-2都是免疫激活劑，能夠刺激B細(xì)胞的激活和增殖。R848是一種合成免疫佐劑，通過Toll樣受體7和8（TLR7/8）激活免疫細(xì)胞，包括B細(xì)胞。當(dāng)R848與TLR結(jié)合時，它會激活免疫細(xì)胞，并刺激促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)免疫反應(yīng)。IL-2是一種由活化的T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在免疫反應(yīng)中通過促進(jìn)免疫細(xì)胞（包括B細(xì)胞）的增殖和激活發(fā)揮關(guān)鍵作用。R848和IL-2共同作用，可以將記憶B細(xì)胞激活為抗體分泌細(xì)胞，用于ELISpot和FluoroSpot實(shí)驗(yàn)。

記憶B細(xì)胞激活步驟:

1. 復(fù)溶重組IL-2

向其中加入1 ml PBS，得到1 ug/ml的人IL-2（或0.5 ug/ml的小鼠IL-2），并在室溫下靜置至少15分鐘。渦旋混勻后立即使用，或分裝后存儲于-20℃。

2. 解凍并洗滌細(xì)胞

將冷凍保存的細(xì)胞在PBS中解凍并洗滌，然后重懸于新鮮完全培養(yǎng)基中。或者，也可以使用新鮮制備的細(xì)胞。

3. 細(xì)胞計(jì)數(shù)與稀釋

計(jì)數(shù)細(xì)胞并稀釋至每毫升200萬細(xì)胞，將1 ml細(xì)胞懸液加入到無菌的24孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板的每個孔中。或者，也可以加入到無菌試管中。

4. 制備要加入每個孔或試管中的R848和重組IL-2激活混合液

使最終激活濃度為R848（1 ug/ml）和重組IL-2（10 ng/ml）。例如，對于8孔細(xì)胞，制備8 ml激活混合液（并額外準(zhǔn)備一些）。需要10 ml激活混合液 = 20 ul R848（1 mg/ml）+ 200 ul IL-2（1 ug/ml）+ 10 ml完全培養(yǎng)基。

5. 加入激活混合液
向每個孔或試管中加入1 ml激活混合液。對于培養(yǎng)板，用無菌水填滿周圍的空孔。

6. 用鋁箔包裹，置于37℃、5% CO?和濕度條件下孵育3-5天。 備注： 經(jīng)過3-5天的激活后，細(xì)胞應(yīng)在組織培養(yǎng)板底部形成小島。這是激活成功的好跡象！孵育3-5天后，培養(yǎng)基不應(yīng)變?yōu)榱咙S色。如果變?yōu)榱咙S色，表明培養(yǎng)基的pH值降低，原因是最初加入的細(xì)胞過多。這將不利于細(xì)胞活性和Ig分泌。

7. 孵育完成后，將細(xì)胞重懸，并用溫?zé)岬耐耆囵B(yǎng)基洗滌兩次。  

8. 將細(xì)胞重懸至適合用于ELISpot/FluoroSpot的濃度。