隨著基因治療技術的快速發(fā)展，眼部基因治療成為治療遺傳性視網膜疾病的一種新興手段。特別是針對Leber先天性黑矇（Leber Congenital Amaurosis, LCA）等疾病的基因治療已經取得了顯著進展。腺相關病毒（AAV）因其高效性和相對安全性，被廣泛用作基因治療的載體。然而，AAV載體及其轉基因產物引發(fā)的宿主免疫反應可能會限制治療效果。“Host Immune Responses after Suprachoroidal Delivery of AAV8 in Nonhuman Primate Eyes”聚焦于經脈絡膜上腔遞送AAV8載體后的宿主免疫反應，特別是其對非人靈長類動物（NHP）眼中的綠色熒光蛋白（GFP）轉基因表達的影響。

方法

1. AAV8載體生產及眼內注射：研究團隊使用了攜帶增強型GFP的AAV8載體，并進行包裝和純化。在動物鎮(zhèn)靜后，使用30號微針將AAV8注射到NHP的脈絡膜上腔或玻璃體內。為了比較不同注射途徑對免疫反應的影響，研究設計了三種注射方案：雙側脈絡膜上腔注射、脈絡膜上腔與視網膜下聯合注射、以及雙側玻璃體內注射。

2. 眼部成像：所有動物在注射前后均進行了掃描激光檢眼鏡（SLO）和光譜域光學相干斷層掃描（SD-OCT）成像，以監(jiān)測轉基因表達情況和眼部炎癥變化。成像數據通過Spectralis HRA+OCT設備捕獲，并分析視網膜形態(tài)和熒光表達情況。

3. 免疫反應評估：體液免疫反應：通過酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中的抗AAV8和抗GFP抗體水平。特別是，研究使用了PROGEN品牌的AAV8 titration ELISA kit（貨號：PRAAV8），該試劑盒專門設計用于AAV8滴度的定量檢測，確保了抗體檢測的準確性和特異性。該方法通過夾心法檢測血清中針對AAV8衣殼的抗體，為評估AAV8載體引發(fā)的體液免疫反應提供了有力工具；細胞免疫反應：通過酶聯免疫斑點試驗（ELISpot）檢測外周血單核細胞（PBMCs）和脾細胞中的干擾素γ（IFN-γ）分泌細胞，以評估T細胞對AAV8衣殼和GFP的反應；生物分布分析：使用定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測肝臟、脾臟和腎臟中的GFP轉基因序列，以評估AAV8載體的系統生物分布情況；免疫組化分析：通過免疫組化技術檢測眼部組織中GFP表達及免疫細胞浸潤情況，進一步確認局部免疫反應。

PROGEN品牌的AAV8 titration ELISA kit

實驗結果

1. 轉基因表達與眼部炎癥：脈絡膜上腔注射AAV8后，在1個月時觀察到廣泛的GFP表達，但隨著時間的推移，GFP表達逐漸局限于鞏膜成纖維細胞。高劑量脈絡膜上腔注射后，部分動物出現了輕度前葡萄膜炎和脈絡膜視網膜炎，經系統糖皮質激素治療后得到緩解。相比之下，視網膜下注射和玻璃體內注射的炎癥反應較輕。

2. 體液免疫反應：ELISA結果顯示，脈絡膜上腔注射AAV8后，動物產生了針對GFP的顯著抗體反應，但針對AAV8衣殼的抗體反應較弱。相比之下，玻璃體內注射AAV8引發(fā)了更強的針對AAV8衣殼的體液免疫反應。這表明脈絡膜上腔注射可能減少了AAV8衣殼向循環(huán)系統的暴露，從而降低了體液免疫反應。

3. 細胞免疫反應：通過ELISpot和流式細胞術分析，發(fā)現脈絡膜上腔注射AAV8后，PBMCs和脾細胞對GFP產生了強烈的T細胞反應，而對AAV8衣殼的反應較弱。這進一步支持了脈絡膜上腔注射可能減少了針對AAV8衣殼的細胞免疫反應。

4. 生物分布：qPCR分析顯示，脈絡膜上腔注射后AAV8在脾臟和肝臟中的分布低于玻璃體內注射，這解釋了脈絡膜上腔注射引發(fā)的體液免疫反應較弱的原因。

本研究表明，脈絡膜上腔注射AAV8載體在NHP眼中能夠引發(fā)廣泛的轉基因表達，但引發(fā)的宿主免疫反應相對較弱。特別是對AAV8衣殼的體液和細胞免疫反應顯著低于玻璃體內注射，這可能與脈絡膜上腔注射減少了AAV8向循環(huán)系統的暴露有關。盡管如此，脈絡膜上腔注射仍引發(fā)了針對轉基因產物GFP的顯著免疫反應，提示在未來的基因治療中需要進一步優(yōu)化載體和轉基因設計，以減少免疫反應對治療效果的影響。PROGEN品牌的AAV8 titration ELISA kit（貨號：PRAAV8）在本研究中發(fā)揮了重要作用。該試劑盒通過夾心法精確檢測血清中針對AAV8衣殼的抗體水平，為評估AAV8載體引發(fā)的體液免疫反應提供了可靠的方法。其準確性和特異性確保了研究結果的可靠性，為深入理解AAV8載體在眼內遞送后的免疫反應機制提供了有力支持。該試劑盒的應用不僅限于本研究，還可廣泛應用于AAV基因治療相關的基礎研究和臨床試驗中，為評估和優(yōu)化基因治療效果提供重要參考。

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