【介紹】

代表各種微環(huán)境的3D細(xì)胞模型對(duì)于準(zhǔn)確的藥物篩選和疾病建模至關(guān)重要。這些模型可以作為體外和體內(nèi)模型，用于進(jìn)行高通量、成本效益高的分析，這對(duì)于發(fā)現(xiàn)生物學(xué)相關(guān)的治療方法至關(guān)重要。為了在藥物發(fā)現(xiàn)研究和篩選中更廣泛地采用3D模型，并使過(guò)程更簡(jiǎn)單，對(duì)高通量篩選和自動(dòng)化處理的需求日益增加，以顯著降低成本時(shí)間。 Advanced Solutions的BioAssemblyBot 400（BAB400）是一種cGMP認(rèn)證的多工具設(shè)備，可用于建立復(fù)雜的生物模型。作為一個(gè)多功能平臺(tái)，它可用于構(gòu)建模型，其氣動(dòng)分配和3D打印能力使其能夠構(gòu)建和處理不同的3D模型或類器官而不受損壞。其液體處理工具可有效地將規(guī)定數(shù)量的細(xì)胞分配在水凝膠、Matrigel 或其他合適的細(xì)胞外基質(zhì)中到多孔板中。

【優(yōu)勢(shì)】

整合3D細(xì)胞模型的開(kāi)發(fā)、維護(hù)和成像的工作流程

易使用且cGMP認(rèn)證的界面，便于BioAssemblyBot 400和ImageXpress 成像儀組合之間的輕松集成和操作

溫度無(wú)關(guān)、無(wú)外源成分的基質(zhì) ，用于3D細(xì)胞模型高通量分析

通過(guò)自動(dòng)化的BAB400和ImageXpress Micro Confocal高內(nèi)涵成像系統(tǒng)（IXM - C）改進(jìn)您的3D細(xì)胞模型的高通量、高內(nèi)涵成像分析

在這項(xiàng)工作中，我們使用VitroGel 基質(zhì)以96孔打印細(xì)胞的3D細(xì)胞結(jié)構(gòu)。TheWell Bioscience的VitroGel是一種可調(diào)節(jié)、無(wú)外源成分（無(wú)動(dòng)物源）的生物功能水凝膠系統(tǒng)，允許最大程度的靈活性來(lái)操縱3D細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。它與溫度無(wú)關(guān)，是動(dòng)物源性細(xì)胞外基質(zhì)（如Matrigel）的極佳替代品，并且可以支持廣泛的細(xì)胞類型和最終結(jié)構(gòu)要求。VitroGel獨(dú)特的剪切稀化和快速恢復(fù)流變特性使其在分配后能夠?qū)崿F(xiàn)出色的細(xì)胞分布，并使其與自動(dòng)化液體處理系統(tǒng)極易使用。 在這項(xiàng)工作中，我們使用患者來(lái)源的三陰性乳腺癌細(xì)胞（引用）與VitroGel基質(zhì)混合，通過(guò)生物打印在96孔創(chuàng)建3D培養(yǎng)物，可用于觀察細(xì)胞生長(zhǎng)作為3D腫瘤球體以及評(píng)估藥物的效果。 我們提出了一種使用VitroGel在集成系統(tǒng)中用于3D細(xì)胞模型的工作流程，以進(jìn)行分配、監(jiān)測(cè)、進(jìn)行藥物篩選分析以及成像和分析數(shù)據(jù)。該系統(tǒng)包括BAB400和ImageXpress Micro Confocal系統(tǒng)（圖1）。

【方法】

用于球體的VitroGel和細(xì)胞懸液 

4IC細(xì)胞 在添加了葡萄糖、NEAA、2mM谷氨酰胺和120μg/L胰島素、10％FBS（Gibco 12491 - 015）的高級(jí)DMEM中培養(yǎng)。對(duì)于分析，球體在DMEM + 10％透析血清（2mM谷氨酰胺，5mM葡萄糖，無(wú)酚紅）中培養(yǎng)。 使用胰蛋白酶收獲患者來(lái)源的三陰性乳腺癌細(xì)胞，并將其懸浮在含有30％FBS的培養(yǎng)基中，濃度為5×10⁵細(xì)胞/mL。3D細(xì)胞培養(yǎng)在VitroGel水凝膠基質(zhì)（SKU：VHM01）中進(jìn)行，步驟如下：

1.將VitroGel水凝膠基質(zhì)置于室溫或加熱至37°C。

2.將水凝膠溶液和細(xì)胞懸浮液以2:1 (v/v)的比例混合。

3.在96孔板的每孔中加入10 μL水凝膠-細(xì)胞混合物(非組織培養(yǎng)處理)

4.在室溫下等待10-15分鐘形成水凝膠。在地層過(guò)程中，不要傾斜或晃動(dòng)孔板，以免影響水凝膠。

5.在水凝膠上仔細(xì)加入90 μL細(xì)胞培養(yǎng)基。

6將孔板置于培養(yǎng)箱中，每隔一天更換一次培養(yǎng)基。

BioAssemblyBot 400用于分配(移液器工具)，介質(zhì)交換，藥物篩選，活死分析BioAssemblyBot 400 BAB400提供了一個(gè)帶有HEPA氣流系統(tǒng)的無(wú)菌環(huán)境。

在使用前至少一小時(shí)（最好過(guò)夜），噴灑并擦拭除工具和任何電子設(shè)備以外的表面，并打開(kāi)HEPA過(guò)濾器功能。使用BAB400的HMI和操縱桿控制器，可以為各種步驟設(shè)計(jì)不同的路徑。使用控制臺(tái)記錄儲(chǔ)液器、板、管、垃圾等的坐標(biāo)，為每個(gè)所需的工作流程設(shè)置路徑。VitroGel中的培養(yǎng)基和細(xì)胞懸液事先在BAB400中準(zhǔn)備好并轉(zhuǎn)移到儲(chǔ)液器中。

圖1. 集成系統(tǒng)工作流程的示意圖[BAB自動(dòng)分配和IXM - C成像] 夾持器（PnP工具）序列可用于開(kāi)蓋和蓋蓋板，并在使用BAB400完成分配后將板移動(dòng)到ImageXpress Micro Confocal系統(tǒng)進(jìn)行成像。BAB400可以選擇在無(wú)人干預(yù)的情況下運(yùn)行多步驟過(guò)程。

通過(guò)將自定義實(shí)驗(yàn)方案結(jié)合在一起以構(gòu)建3D細(xì)胞模型，實(shí)驗(yàn)可以轉(zhuǎn)化為自動(dòng)化工作流程。BioApps  Maker是一種易于制作和自動(dòng)化的解決方案，用于自動(dòng)化3D模型的獨(dú)立分配、維護(hù)和成像的一系列步驟。 例如，涉及的水凝膠分配序列步驟如下： 獲取吸頭→移液器工具移動(dòng)到水凝膠儲(chǔ)液器→向下（進(jìn)入儲(chǔ)液器）→混合Y次（以定義的速度吸取然后分配）→移動(dòng)到板（左/右/方向 - 然后孔中心）→分配（定義體積和分配速度）→將吸頭丟棄（到BAB400中的生物危害袋中）。可以為培養(yǎng)基吸取和分配設(shè)計(jì)類似的路徑 - 吸頭到達(dá)孔的邊緣以保持VitroGel圓頂完整。含有選擇藥物和Live / dead染色劑的培養(yǎng)基也可用于球體的進(jìn)一步處理和成像分析。可選步驟：將BAB400的溫度控制階段預(yù)冷卻至10°C，以加快96孔中分配的VitroGel液滴的凝膠化。 ImageXpress Micro Confocal成像和分析 在BAB400將微孔板移動(dòng)到ImageXpress Micro Confocal成像儀（Molecular Devices）后，使用MetaXpress 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件獲取透射光（TL）或熒光圖像。使用共聚焦模式，使用4X或10X物鏡獲取球體的Z堆棧圖像。所有分析均使用MetaXpress圖像分析軟件進(jìn)行。BioApps 可以提取并執(zhí)行特定序列或?qū)嶒?yàn)的正確預(yù)選成像采集和分析文件。

【結(jié)果】 

通過(guò)BAB400和手動(dòng)操作，在多個(gè)96孔板中接種了4IC乳腺癌細(xì)胞在VitroGel圓頂中。在第3天使用Cyto3D Live - Dead Assay Kit（TheWell Bioscience，SKU：BM01）染色進(jìn)行活死計(jì)數(shù)觀察，并使用上述成像方法進(jìn)行分析。活死分析用于計(jì)算活細(xì)胞和死細(xì)胞。顯然，手動(dòng)接種或自動(dòng)接種的細(xì)胞之間的細(xì)胞活力沒(méi)有顯著差異。BAB400工作流程的平均活力為93％，而手動(dòng)分配的孔板的活力為92.4％（圖2）。因此，自動(dòng)化細(xì)胞打印不影響細(xì)胞活力。

圖2. A. BAB ；B. 手動(dòng)分配的VitroGel和三陰性乳腺癌細(xì)胞（4IC）用Cyto3D染色（綠色 - 活，紅色 - 死），并在第3天使用IXM - C成像。使用MetaXpress軟件分析相同數(shù)據(jù)的圖形表示（C.）。

為了測(cè)試藥物治療的工作流程，在第3天向多孔板中加入藥物Trametinib和Idarubicin，使其最終濃度達(dá)到4μM，并在治療48小時(shí)后的第5天評(píng)估其效果。與對(duì)照相比，我們觀察到兩種藥物治療中細(xì)胞活力均顯著降低（圖3）。如上述所述，用活力染料染色后，通過(guò)成像方法確定細(xì)胞活力。在4μM Idarubicin中，死細(xì)胞百分比最高，球體中97％的細(xì)胞死亡，而在Trametinib的情況下為66.4％，對(duì)照為7.5％（圖3）。

 圖3. 細(xì)胞用BAB分配（VitroGel和三陰性乳腺癌細(xì)胞（4IC））。對(duì)照（A）和處理樣品用Cyto3D（綠色 - 活，紅色 - 死）和DAPI（藍(lán)色 - 核）染色，處理 - 用Trametinib（B）和Idarubicin（C）在4μM濃度下處理48小時(shí)。這些在第5天使用IXM - C成像。使用MetaXpress軟件分析相同數(shù)據(jù)的圖形表示（D）。

【結(jié)論】

通過(guò)將 BAB400 和 ImageXpress Micro Confocal 成像儀與易于處理和可調(diào)節(jié)的 ECM 基質(zhì)（VitroGel）集成，用于 2D/3D 細(xì)胞培養(yǎng)、3D 細(xì)胞模型的維護(hù)和分化，可實(shí)現(xiàn) 3D 細(xì)胞模型工作流程的自動(dòng)化，該模型可用于化合物篩選和各種分析。這將通過(guò)節(jié)省時(shí)間和成本并減少重復(fù)步驟，有效地促進(jìn)正在進(jìn)行的基礎(chǔ)、藥理和生物醫(yī)學(xué)研究以及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。

【參考】

Cromwell EF, Sirenko O, Nikolov E, Hammer M, Brock CK, Matossian MD, Alzoubi MS, Collins - Burow BM, Burow ME. Multifunctional profiling of triple - negative breast cancer patient - derived tumoroids for disease modeling, SLAS Discovery 2022, 27(3): 191–200., https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35124274/