傳統(tǒng)的DNA克隆方法主要采用限制性酶切與連接的方法，通過使用限制性內(nèi)切酶切割目標(biāo)DNA片段和克隆載體，然后使用DNA連接酶將兩者連接起來。但是這種方法存在很多缺陷，如果目標(biāo)DNA片段或克隆載體缺乏適合的酶切位點(diǎn)，就需要進(jìn)行額外引入適當(dāng)?shù)男蛄谢蚴褂闷渌拗菩詢?nèi)切酶，費(fèi)時費(fèi)力，過程繁冗，而且限制性酶切與連接方法的連接效率和精確性可能受到多種因素的影響，如酶切位點(diǎn)的完整性、連接酶的效能和條件、連接反應(yīng)的溫度和時間等。眾多因素都可能導(dǎo)致連接產(chǎn)物的多樣性和不確定性。 

基于重組原理的無縫克隆技術(shù)，作為新一代的克隆方法，不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補(bǔ)平等操作，可以有效克服限制性酶切與連接的缺點(diǎn)，依據(jù)DNA片段與線性化載體末端的15~25 nt同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點(diǎn)，載體自連背景極低，是一種簡單、快速、高效的DNA定向克隆技術(shù)。

 Biogradetech的FlyCut? DNA Assembly Mix Plus無縫克隆預(yù)混液，一次反應(yīng)可完成單至多個 DNA 片段的重組，最快僅需 5分鐘即可完成單片段重組，且陽性率高于95%。預(yù)混液中添加的輔助因子，有效提高克隆陽性率；經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系，能夠一定程度上耐受未純化 PCR 產(chǎn)物中含有的雜質(zhì)。升級版的無縫克隆試劑盒具有更高的陽性率、更好的兼容性。

多片段DNA無縫克隆流程

1.線性化克隆載體制備

選擇合適的克隆位點(diǎn)，對載體進(jìn)行線性化，載體的線性化可以通過酶切或反向 PCR 擴(kuò)增完成。 

1.1酶切制備：一些限制性內(nèi)切酶不能有效地消化超螺旋 DNA，因此可能會留下不同數(shù)量的未切割載體 DNA，降低陽性率。推薦使用 FlyCut?快速內(nèi)切酶進(jìn)行酶切（單酶切或者雙酶切），使載體線性化完全，以降低轉(zhuǎn)化背景（未切割的載體轉(zhuǎn)化獲得的假陽性克隆） 

1.2反向 PCR擴(kuò)增制備：為減少擴(kuò)增突變的引入，推薦使用高保真 PCR Mix 進(jìn)行擴(kuò)增。推 薦使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為模板，以減少環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留對克隆陽性率的影響。

2.插入片段PCR引物設(shè)計(jì)

PCR 引物的5'端必須包含與其相鄰片段（插入片段或載體）末端同源的15~25 nt（推薦18 nt）序列。假如載體為粘性末端，且3' 端突出，則引物設(shè)計(jì)必須包含突出部分；若5'端突出，則引物設(shè)計(jì)可以包含突出部分，也可以不包含。 

插入片段正向擴(kuò)增引物：5'-上游載體末端同源序列+酶切位點(diǎn)（可選）+基因特異性正向擴(kuò)增序列- 3' 

插入片段反向擴(kuò)增引物：3'-基因特異性反向擴(kuò)增序列+酶切位點(diǎn)（可選）+下游載體末端同源序列-5'  

本產(chǎn)品中所提供的pUC19載體（Ampr）連接端序列如下：

3.插入片段的 PCR 擴(kuò)增

推薦使用高保真PCR 預(yù)混液進(jìn)行擴(kuò)增，以減少擴(kuò)增突變的引入。

建議使用純化后的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行無縫克隆反應(yīng)，若PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，可直接使用，但加樣體積不應(yīng)超過總反應(yīng)體積的20%。  

4.重組反應(yīng)

4.1于冰水浴中配置以下反應(yīng)體系：

（a）最適載體用量 (ng) = 0.02 ×載體堿基對數(shù)，即03 pmol。

（b）插入單片段，最適片段用量（ng）= 0.04 ×片段堿基對數(shù)；插入多片段，每片段最適用量（ng）= 0.02 ×片段堿基對數(shù)。 

重組反應(yīng)體系配制完成后，用移液槍輕輕吸打混勻各組分，避免 產(chǎn)生氣泡，切勿渦旋。 

4.2將反應(yīng)體系置于 50℃，反應(yīng) 5~60 min。 

4.3將反應(yīng)液離心管置于冰上冷卻，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化或者儲存于 -20℃。  

5.重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

取 5~10ul反應(yīng)液，加入到100ul感受態(tài)細(xì)胞中，緩慢吸打混勻，冰上放置 30 min。42℃熱激 45~60 sec，冰浴5 min。加500ul SOC或LB培養(yǎng)基，37℃ 振蕩培養(yǎng)40~60 min（200 rpm）。將菌液均勻涂布在含有對應(yīng)抗生素的平板上，倒置于37℃過夜培養(yǎng)。  

6.陽性克隆檢測

挑取單菌落至10ul ddH2O中混勻，95℃裂解10min后，取1ul裂解液作為模板，進(jìn)行菌落PCR鑒定，或?qū)尉浣臃N至抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。陽性對照的陽性克隆檢測，菌落PCR引物使用通用引物M13F與M13R，酶切鑒定用HindIII與EcoRI。

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT M13R：CAGGAAACAGCTATGAC   

Biogradetech生命科學(xué)和醫(yī)藥研發(fā)行業(yè)關(guān)鍵原料與試劑的供應(yīng)商：Biogradetech成立于2015年，總部位于美國加利福尼亞州，早期以產(chǎn)品技術(shù)研發(fā)服務(wù)起家，逐步發(fā)展了廣泛的產(chǎn)品線，并將其商業(yè)化銷售，包括蛋白質(zhì)、抗體、酶、培養(yǎng)基、試劑盒和儀器。適用于細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、診斷學(xué)、生物化學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、血液分析和高通量藥物篩選等領(lǐng)域。