要讓ELISpot或FluoroSpot實(shí)驗(yàn)提供有價(jià)值的信息，通常需要在體外對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激。刺激物不僅可以用于識(shí)別抗原特異性免疫反應(yīng)，還可以作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。選擇合適的刺激物主要取決于細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)的具體需求。刺激物可以是單克隆抗體、肽庫(kù)、合成化合物，或者是從細(xì)菌或植物中提取的天然物質(zhì)。Mabtech提供多種經(jīng)過(guò)驗(yàn)證和優(yōu)化的多克隆和抗原特異性刺激劑試劑，適用于ELISpot和FluoroSpot實(shí)驗(yàn)。其中，大多數(shù)試劑為單克隆抗體或肽庫(kù)（我們稱之為PepPools）。PepPools可用于實(shí)驗(yàn)對(duì)照，也可用于識(shí)別抗原特異性免疫反應(yīng)。

針對(duì)特定研究問(wèn)題的刺激

PepPools有兩種形式：定義明確的肽庫(kù)和掃描肽庫(kù)：

掃描肽庫(kù)：不需要事先了解表位信息，其設(shè)計(jì)目的是覆蓋整個(gè)蛋白質(zhì)或特定結(jié)構(gòu)域。它們通常以15個(gè)氨基酸的肽段形式生產(chǎn)，且每個(gè)肽段之間有11個(gè)氨基酸的重疊，從而覆蓋整個(gè)目標(biāo)蛋白質(zhì)。15個(gè)氨基酸的肽段能夠刺激CD4+ T細(xì)胞，當(dāng)加入細(xì)胞培養(yǎng)中時(shí)，它們可以被蛋白酶進(jìn)一步修剪成較短的肽段，從而刺激CD8+ T細(xì)胞。因此，掃描肽庫(kù)可用于刺激任何物種的任何T細(xì)胞。一般來(lái)說(shuō)，如果您不確定研究群體中的HLA/MHC組成，掃描肽庫(kù)是一個(gè)更安全的選擇。

定義明確的肽庫(kù)：在產(chǎn)品名稱中會(huì)標(biāo)明特定物種，它們包含針對(duì)特定HLA/MHC分子的已定義肽段。這些肽段已被Mabtech或其他研究者鑒定為免疫優(yōu)勢(shì)肽段，因此能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。如果您確定研究群體中的HLA組成能夠被覆蓋，那么定義明確的肽庫(kù)是首選。

Mabtech提供針對(duì)一些常見(jiàn)病原體的肽庫(kù)，并且產(chǎn)品列表在不斷增加。如果您正在考慮使用Mabtech的肽庫(kù)進(jìn)行研究，但尚未購(gòu)買ELISpot或FluoroSpot試劑盒，可以查看Mabtech的Path Kits——這些是包含肽庫(kù)的完整且經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的試劑盒。請(qǐng)注意，Mabtech的肽庫(kù)可用于研究問(wèn)題，但由于例如EBV（Epstein-Barr病毒）和CMV（巨細(xì)胞病毒）在人類群體中高度流行，某些肽段庫(kù)也可以用作陽(yáng)性對(duì)照。

為什么Mabtech有這么多針對(duì)SARS-CoV-2的肽段庫(kù)？因?yàn)樗鼈兛梢杂糜诓煌哪康牟⒒卮鸩煌膯?wèn)題。

SARS-CoV-2 (SNMO)肽庫(kù)(貨號(hào)3622-1) 是用于解答有關(guān)COVID-19免疫的一般性問(wèn)題的首選產(chǎn)品。然而，如果您發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 (SNMO)肽庫(kù)沒(méi)有涵蓋您所需的HLA類型，那么SARS-CoV-2 (S1)掃描肽庫(kù)(貨號(hào)3629-1)將是一個(gè)更好的選擇。拉霍亞Sette實(shí)驗(yàn)室（Yu等人，《細(xì)胞宿主與微生物》，2022年）的一項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了如何通過(guò)分別檢測(cè)針對(duì)刺突蛋白和非刺突蛋白的IFN-γ反應(yīng)來(lái)區(qū)分疫苗接種和感染引發(fā)的免疫反應(yīng)。因此，SARS-CoV-2 (NMO)肽庫(kù)（貨號(hào)3632-1）可以與SARS-CoV-2 (NMO)肽庫(kù)（貨號(hào)3632-1）結(jié)合使用，以區(qū)分SARS-CoV-2感染和疫苗接種。最后，SARS-CoV-2奧密克戎BA.1 (S1)，掃描肽庫(kù)（貨號(hào)3636-1）可用于評(píng)估對(duì)奧密克戎BA.1突變的反應(yīng)。為什么Mabtech有這么多針對(duì)SARS-CoV-2的肽段庫(kù)？因?yàn)樗鼈兛梢杂糜诓煌哪康牟⒒卮鸩煌膯?wèn)題。

請(qǐng)注意，肽庫(kù)小瓶可以合并使用，以便更好地契合當(dāng)前的研究問(wèn)題。也許您只想觀察結(jié)核病（TB）的反應(yīng)性，而不關(guān)心是哪種特定抗原引發(fā)了反應(yīng)？也許您對(duì)CD4與CD8的反應(yīng)不感興趣，而只關(guān)心總的T細(xì)胞反應(yīng)？也許您想合并肽庫(kù)（例如EBV+CMV），以便在陽(yáng)性對(duì)照中覆蓋更多的HLA類型？這是可行的！唯一的風(fēng)險(xiǎn)是DMSO（二甲基亞砜）的濃度過(guò)高，可能導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷并對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。為了解決這個(gè)問(wèn)題，請(qǐng)僅在第一個(gè)小瓶中加入40微升DMSO，然后將所有內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到下一個(gè)小瓶中，如果需要合并三個(gè)小瓶，則繼續(xù)轉(zhuǎn)移到下一個(gè)。記得用PBS沖洗小瓶。

作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照的刺激物

用于T細(xì)胞多克隆激活的常用試劑是植物血凝素（PHA）或佛波酯/離子霉素（PMA/Ionomycin）。然而，在Mabtech看來(lái)，抗原特異性刺激通常也更適合用于對(duì)照孔，因?yàn)檫@些試劑經(jīng)過(guò)了很好的定義，并且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞更“生理學(xué)上正確”的激活。抗原特異性刺激的一個(gè)缺點(diǎn)是，它們可能并不適用于所有HLA類型或物種。

T細(xì)胞多克隆激活

某些選定的抗CD3抗體可以作為T(mén)細(xì)胞的多克隆激活劑。Mabtech提供針對(duì)人和猴CD3的單克隆抗體，這些抗體能夠誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的釋放。使用體外生產(chǎn)的單克隆抗體，確保了批次間低變異性——這比植物凝集素等試劑更具優(yōu)勢(shì)。

植物凝集素：植物血凝素（PHA）和刀豆蛋白A（ConA）是強(qiáng)效的T細(xì)胞激活劑。目前，Mabtech不提供植物凝集素，但PHA和ConA可以從許多不同的供應(yīng)商處購(gòu)買，并且有不同效力的產(chǎn)品可供選擇。

抗原特異性T細(xì)胞刺激

已知能夠誘導(dǎo)特異性反應(yīng)的抗原也作為陽(yáng)性對(duì)照具有重要價(jià)值。ELISpot或FluoroSpot的一個(gè)主要應(yīng)用領(lǐng)域是檢測(cè)抗原特異性人CD8 T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ。為此，Mabtech開(kāi)發(fā)了一種抗原特異性的陽(yáng)性對(duì)照，即CEFRAS (CD8)肽庫(kù)（貨號(hào)3637-1）。Mabtech還提供用于刺激CD4 T細(xì)胞的CEFTA (CD4)肽庫(kù)（貨號(hào)3617-1），以及一個(gè)更全面的CEF版本，即CEF擴(kuò)展肽庫(kù)（貨號(hào)3618-1）。這三種肽段庫(kù)也可以用于流式細(xì)胞術(shù)。

CEFRAS (CD8)肽庫(kù)（貨號(hào)3637-1）能夠刺激CD8+ T細(xì)胞產(chǎn)生例如IFN-γ、IL-2、顆粒酶B、穿孔素和TNF-α等細(xì)胞因子。該肽段庫(kù)包含210種肽段，這些肽段是來(lái)自18種病原體的MHC I類限制性T細(xì)胞表位，包括柯薩奇病毒B4、人腺病毒5型、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、水痘-帶狀皰疹病毒、Epstein-Barr病毒、巨細(xì)胞病毒、人類皰疹病毒6型、人乳頭瘤病毒、流感病毒A型、JC多瘤病毒、麻疹病毒、結(jié)核分枝桿菌、呼吸道合胞病毒、SARS-CoV-2、弓形蟲(chóng)、天花病毒和黃熱病病毒。該肽段庫(kù)旨在刺激T細(xì)胞，覆蓋來(lái)自不同種族背景的廣泛HLA類型。肽段在偶聯(lián)后進(jìn)行了封端處理。

CEF (CD8)肽庫(kù)（貨號(hào)3616-1）由23種病毒肽組成，能夠刺激人CD8 T細(xì)胞產(chǎn)生主要為IFN-γ的反應(yīng)，覆蓋約90%的白種人。這些肽段包含來(lái)自巨細(xì)胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）和流感病毒的MHC I類限制性T細(xì)胞表位，旨在刺激具有多種HLA類型的供體的T細(xì)胞。它還能在許多個(gè)體的細(xì)胞中誘導(dǎo)穿孔素和顆粒酶B的反應(yīng)。除了作為陽(yáng)性對(duì)照外，CEF肽段庫(kù)還適用于標(biāo)準(zhǔn)化程序。

CEF擴(kuò)展肽庫(kù)（貨號(hào)3618-1）由32種病毒肽組成，能夠刺激人CD8 T細(xì)胞產(chǎn)生主要為IFN-γ的反應(yīng)，覆蓋約90%的白種人。這些肽段包含來(lái)自巨細(xì)胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）和流感病毒的MHC I類限制性T細(xì)胞表位，旨在刺激具有多種HLA類型的供體的T細(xì)胞。它還能在許多個(gè)體的細(xì)胞中誘導(dǎo)穿孔素和顆粒酶B的反應(yīng)。

CEFTA (CD4)肽庫(kù)（貨號(hào)3617-1）由35種MHC II類限制性病毒肽組成，這些肽段來(lái)自人巨細(xì)胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）、流感病毒、破傷風(fēng)毒素和腺病毒5型。CEFTA肽段庫(kù)能夠刺激人CD4 T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-2、IL-5和IL-13，推薦作為使用人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）進(jìn)行ELISpot和FluoroSpot實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。

CD4和CD8細(xì)胞的分別耗竭，揭示CEF (CD8)肽庫(kù)（貨號(hào)3616-1）確實(shí)主要刺激CD8 T細(xì)胞。

多克隆單核細(xì)胞/樹(shù)突狀細(xì)胞刺激

Toll樣受體（TLRs）的配體可以作為陽(yáng)性對(duì)照來(lái)刺激單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。從細(xì)菌中純化的脂多糖（LPS）通過(guò)TLR4發(fā)揮作用，是例如IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的強(qiáng)效刺激物。化合物R848是TLR7/8的配體，能夠刺激例如IL-1β的分泌。

目前，Mabtech不提供LPS。Mabtech不單獨(dú)提供R848，但它（連同IL-2）是StimPack(貨號(hào)3660-1，StimPack: Memory B cells, human)的一部分，因此可以從Mabtech這里獲得。

多克隆B細(xì)胞刺激

記憶B細(xì)胞在分泌可檢測(cè)量的抗體之前需要多克隆刺激。這些細(xì)胞可以使用StimPack(貨號(hào)3660-1，StimPack: Memory B cells, human)或StimPack（貨號(hào)3661-1，StimPack: Memory B cells, mouse）進(jìn)行刺激；這是一種合成化合物R848（TLR 7/8激動(dòng)劑）和重組IL-2的混合物。