酶聯(lián)免疫斑點（ELISpot）是一種用于定量分析分泌分析物細胞數(shù)量的靈敏方法。細胞分泌的細胞因子、免疫球蛋白或其他目標蛋白在分泌后以及整個刺激過程中會被特異性抗體立即捕獲。這種即時捕獲使得ELISpot成為一種極為靈敏的夾心法檢測，靈敏度可達單細胞水平。ELISpot檢測原理：將細胞培養(yǎng)在包被有特異性捕獲抗體的孔底部的膜表面，并在有或無刺激物的條件下進行培養(yǎng)。因此，細胞分泌的目標蛋白會被立即捕獲。經(jīng)過適當?shù)姆跤龝r間后，去除細胞，并使用檢測抗體檢測分泌的分析物。通過使用產(chǎn)生沉淀產(chǎn)物的底物，最終結(jié)果是在膜表面形成可見的斑點。每個斑點對應(yīng)一個分泌蛋白的單個細胞的“足跡”。

ELISpot實驗流程示意圖

1. 用捕獲抗體包被培養(yǎng)板

ELISpot培養(yǎng)板是一種塑料微孔板，其96個孔的底部都有一層聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，這與僅由塑料制成的ELISA培養(yǎng)板不同。PVDF膜提供了更大的膜表面積，從而增加了可以結(jié)合的捕獲抗體的量；這一特性對于成功的ELISpot實驗至關(guān)重要。

PVDF膜在高倍放大鏡下類似海綿

1.1 ELISpot培養(yǎng)板（PVDF膜ELISpot板）

Mabtech可提供兩種類型的ELISpot培養(yǎng)板：MSIP 和MAIPSWU 

MSIP培養(yǎng)板底部附有塑料保護墊，有透明（貨號3654-TP-10）和白色（貨號3654-WP-10）兩種形式可供選擇。這兩種顏色的板子在ELISpot讀板儀中呈現(xiàn)略有不同的外觀，但并不會影響實驗結(jié)果。MSIP板的一個關(guān)鍵特征是它在左上角有一個“切角”。

MAIPSWU培養(yǎng)板，也被稱為ELIIP，是白色形式的。它沒有底部保護墊，但是底部有一個可拆卸的托盤。在洗滌步驟中，可以將培養(yǎng)板從托盤中取出。MAIPSWU培養(yǎng)板的一個關(guān)鍵特點是它在頂部和底部的右上角有兩個“切角”。

1.2 乙醇預(yù)處理和培養(yǎng)板包被（*務(wù)必仔細操作）

就像一塊干海綿一樣，PVDF膜在能夠吸收（結(jié)合）所需量的捕獲抗體之前需要先被潤濕。需要使用乙醇來達到這個目的，因為乙醇可以使膜變得親水。此外，使用推薦濃度的捕獲抗體（這可能會因分析物而異，但通常為15 ug/ml）可以優(yōu)化斑點的外觀。如果你將捕獲抗體稀釋到低于推薦濃度，你可能會得到模糊不清的斑點，這些斑點很難計數(shù)。

1.3 如何包被ELISpot板

1.21 向包被的所有孔中加入新配制的乙醇（用99.5%的原液在無菌水中稀釋）。乙醇與膜接觸后，膜會立刻變成淡灰色，這表明PVDF已經(jīng)被激活。如果你打算包被多個培養(yǎng)板，一次只處理一個或兩個培養(yǎng)板，以確保在乙醇的短暫孵育時間內(nèi)完成操作。不要讓乙醇停留時間過長！

-MSIP培養(yǎng)板——向每個孔中加入20 ul乙醇（35%）。乙醇在孔中停留時間不超過1分鐘。

-MAIPSWU培養(yǎng)板——向每個孔中加入50 ul乙醇（70%）。乙醇在孔中停留時間不超過2分鐘。

1.2.2 對于MAIPSWU培養(yǎng)板，倒空培養(yǎng)板，并用無菌水洗滌5次（每次200 ul/孔）。對于MSIP培養(yǎng)板，你可以先在孔中加入無菌水，而無需移除乙醇，然后用無菌水洗滌5次（每次200 ul/孔）。

1.2.3 倒空培養(yǎng)板。加入用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋的包被抗體（100 ul/孔）。我們通常推薦包被抗體濃度為15 ug/ml（每孔1.5 ug抗體），但請查看具體產(chǎn)品的實驗方案以獲取詳細信息。將包被有抗體溶液的培養(yǎng)板在4-8°C下放置過夜。

培養(yǎng)板處理tips: 在實驗過程中，不要讓培養(yǎng)板的膜變干。如果在乙醇預(yù)處理過程中培養(yǎng)板的膜變干了——不要驚慌，只需重復(fù)乙醇預(yù)處理步驟即可。小貼士！在洗滌步驟中，先將最后一次洗滌的液體留在孔中，然后準備好下一步所需的所有物品，再倒空培養(yǎng)板。

輕輕處理培養(yǎng)板，注意不要對培養(yǎng)板的底部施加壓力。握住培養(yǎng)板的邊緣，而不是頂部或底部，并且在倒空培養(yǎng)板時避免使用過大的力量。不要讓移液器的槍頭接觸到膜，因為這可能會損壞膜并導(dǎo)致出現(xiàn)假象。

確保加入的溶液/試劑能夠覆蓋孔。在移液時也要避免產(chǎn)生氣泡，因為氣泡可能會阻礙試劑到達孔的底部。溶液覆蓋不全或產(chǎn)生氣泡可能會導(dǎo)致在顯色后出現(xiàn)空白孔。

當需要在無菌環(huán)境中操作時，例如在層流罩中，使用多通道移液器來洗滌培養(yǎng)板。當不需要無菌條件時（請查看產(chǎn)品說明書），可以使用ELISA培養(yǎng)板自動洗板器，但要確保調(diào)整洗滌器噴頭的位置，以適應(yīng)ELISpot培養(yǎng)板較淺的孔。

2. 向培養(yǎng)板中加入細胞和刺激物

無論是自己包被培養(yǎng)板，還是使用Mabtech提供的預(yù)包被培養(yǎng)板，到這個階段，ELISpot培養(yǎng)板已經(jīng)準備好接受你的細胞（在添加200 ul與用于細胞培養(yǎng)的相同培養(yǎng)基以封閉培養(yǎng)板，并在室溫下孵育30分鐘之后——請遵循實驗方案）。作為一種基于細胞的方法，細胞的活性對于成功的ELISpot實驗至關(guān)重要。細胞在有或無激活刺激物（抗原或多克隆刺激劑）的條件下進行孵育，通常在適當?shù)臏囟龋话闶?7℃。孵育時間應(yīng)允許細胞最佳地分泌分析物，因此可以從幾小時到幾天不等。建議所有條件下都設(shè)置三份重復(fù)孔進行實驗。

2.1 幾乎所有細胞來源都可以使用——只要細胞是活的

ELISpot幾乎可以應(yīng)用于任何細胞來研究蛋白質(zhì)分泌。目前已經(jīng)有多種細胞的研究成果，包括人血液細胞、小鼠脾細胞、細胞培養(yǎng)物、黏膜組織細胞、異質(zhì)細胞群、純化的均質(zhì)細胞以及細胞克隆。至少在人類樣本中，最常用的細胞是外周血單個核細胞（PBMCs）。它們可以通過密度梯度離心（例如使用Ficoll）從血液中獲得。得到的PBMCs可以直接使用，也可以冷凍保存以供日后使用。細胞冷凍和解凍的要求如下：

細胞質(zhì)量對于獲得可靠的結(jié)果至關(guān)重要。

使用活細胞比例高、凋亡細胞或死亡細胞比例低的樣本，將使您獲得成功的最大可能性。這不僅適用于ELISpot，而且適用于任何基于細胞的實驗。如果您的樣本中含有高比例的死亡細胞，您不能依賴最終結(jié)果，因為這些結(jié)果是基于反應(yīng)細胞（斑點形成單位）與總細胞的比例得出的。

如果操作得當，凍存和解凍細胞并不是問題。但需要注意的是，外周血單個核細胞（PBMCs）應(yīng)在采血后盡快制備。這是因為從采血后超過大約8小時的血液樣本中制備的細胞可能會受到粒細胞的污染，從而干擾實驗結(jié)果。如果必須在制備前儲存血液樣本（例如，如果您在下午晚些時候收到樣本，需要過夜保存），則可以通過以下方法獲得高質(zhì)量的PBMCs：

- 輕輕攪動血液樣本。

- 用PBS或RPMI將血液樣本按1:1的比例稀釋。

- 使用商業(yè)耗竭試劑盒從血液樣本中耗竭粒細胞。

2.2 選擇適合您細胞的培養(yǎng)基

培養(yǎng)基對細胞的健康至關(guān)重要。Mabtech推薦使用含有L-谷氨酰胺和10%胎牛血清（FCS）的RPMI 1640培養(yǎng)基用于大多數(shù)細胞。在Mabtech，通常會在培養(yǎng)基中添加HEPES以維持細胞培養(yǎng)的pH值，并添加抗生素以降低污染的風(fēng)險。由于RPMI 1640可能并非您實驗的最佳培養(yǎng)基，您必須查閱相關(guān)資料，檢查哪種培養(yǎng)基最適合您所研究的細胞。一般來說，我們推薦使用FCS作為血清來源。不同批次的血清在成分和功能上可能存在差異，因此在用于ELISpot之前，明智的做法是測試新的血清批次。所選用的血清應(yīng)能夠支持細胞培養(yǎng)并產(chǎn)生低背景染色，即不應(yīng)引起細胞激活或蛋白質(zhì)分泌。我們建議您不要使用同源血清（例如，用于人類樣本的人類血清），因為它可能含有您打算檢測的分析物和/或異嗜性抗體，這兩者都可能引起背景噪聲。如果在您的實驗中不能使用胎牛血清（FCS），可以使用含有特定蛋白質(zhì)的無血清培養(yǎng)基作為血清的替代品。在我們測試過的所有無血清培養(yǎng)基中，AIM-V最適合用于ELISpot實驗。無論您選擇哪種細胞培養(yǎng)基，至關(guān)重要的是在整個實驗過程中，包括在添加細胞之前的封閉/調(diào)節(jié)步驟，都要使用相同的培養(yǎng)基。使用相同的培養(yǎng)基可以確保細胞在每個步驟中的環(huán)境保持一致，從而減少可能通過非特異性刺激影響最終結(jié)果的變量數(shù)量。

Mabtech內(nèi)部使用的培養(yǎng)基：RPMI 1640, 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 100 ug/mL penicillin, 100 ug/mL streptomycin

2.3 選擇合適的細胞數(shù)量

此時，培養(yǎng)板已經(jīng)用捕獲抗體包被，并在室溫下用細胞培養(yǎng)基調(diào)節(jié)（封閉）至少1小時。在將細胞加入培養(yǎng)板之前，您需要對細胞進行計數(shù)，并將細胞濃度調(diào)整到所需的濃度。細胞計數(shù)可以通過自動細胞計數(shù)儀或使用顯微鏡進行臺盼藍染色來完成。由于只有活細胞才能分泌分析物，因此請確保在細胞計數(shù)中排除死亡細胞，并且如果可能的話，排除凋亡細胞。如果細胞濃度低于所需濃度，需要通過離心來濃縮細胞。

以下幾點需要注意：

- 如果不確定合適的細胞數(shù)量，可以從每孔250,000個細胞開始。每孔的細胞數(shù)量必須根據(jù)細胞類型和預(yù)期的分泌細胞頻率進行調(diào)整：預(yù)期的反應(yīng)細胞頻率越低，每孔所需的細胞數(shù)量就越高。如果預(yù)期頻率是1/10,000個細胞，您將需要每孔大約250,000個細胞。相反，當頻率較高時，例如1/100個細胞，每孔加入50,000個細胞就足夠了。一般來說，抗原特異性反應(yīng)需要更高的細胞數(shù)量（例如，每孔250,000個細胞），而多克隆/絲裂原陽性對照（例如，PHA，每孔50,000個細胞）則不需要那么多細胞。

- 細胞“喜歡”與其他細胞接觸。在ELISpot中測量的斑點形成單位的數(shù)量并不總是與總細胞數(shù)量相關(guān)，因為需要一定數(shù)量的細胞才能實現(xiàn)適當?shù)募毎g接觸，從而實現(xiàn)最佳刺激。例如，在分析PBMC樣本中的抗原特異性T細胞時，每孔的總細胞數(shù)量不應(yīng)少于200,000個細胞。

- 避免渦旋。使用移液槍輕輕重懸細胞和沉淀物。

- 在將細胞加入ELISpot培養(yǎng)板之前，有時刺激細胞是有益的。對于需要較長時間才能開始分泌的分析物，可以在將細胞加入ELISpot培養(yǎng)板之前對細胞進行預(yù)刺激（最好在圓底聚丙烯管或培養(yǎng)板中進行，以增加細胞接觸）。在某些情況下，這是一種良好的實踐，例如，用R848 + IL-2刺激記憶B細胞72小時，以促進其分化為分泌免疫球蛋白的漿細胞。如果您選擇預(yù)刺激，重要的是要注意，細胞在加入ELISpot培養(yǎng)板之前必須進行洗滌，以避免膜的背景染色。

2.4 接種并刺激細胞

當您選擇了適合實驗的細胞數(shù)量后，終于可以將細胞接種到培養(yǎng)板上并進行刺激了。除了您感興趣的刺激物外，我們建議您同時設(shè)置三種對照：

選擇用于對照刺激的相關(guān)化合物在很大程度上取決于細胞類型和您實驗的性質(zhì)。刺激物可以是單克隆抗體（T細胞的抗CD3抗體）、肽段（CD8?T細胞的CEFRAS肽池，或CD4?T細胞的CEFTA肽池）、合成化合物（B細胞的R848+IL-2），或者是從細菌或植物中純化的物質(zhì)（T細胞的PHA）。在Mabtech看來，使用肽池或單克隆抗體進行抗原特異性刺激是更可取的，因為這些試劑的特性已經(jīng)明確。

對于所有類型的刺激，抗原特異性或多克隆，Mabtech推薦以下兩種技術(shù)：

I. 先加刺激物，再加細胞	II. 將細胞和刺激物混合后再加入板
采用這種方法時，刺激物和細胞將分別加入培養(yǎng)板中。當依次向每個孔中加入等體積的刺激物和細胞（各50微升）時，刺激物和細胞懸浮液應(yīng)按最終實驗濃度的2倍進行配制。細胞濃度為5×10?個細胞/毫升時，每孔將有250,000個細胞。至關(guān)重要的是要先加入刺激物，然后再加入細胞。在細胞接種后，不要再向孔中加入任何東西，因為這可能會將細胞推向孔的邊緣，從而導(dǎo)致結(jié)果不理想。	在試管中將細胞和刺激物混合至最終實驗濃度。每孔加入100微升；細胞濃度為2.5×10?個細胞/毫升時，每孔將有250,000個細胞。由于細胞會持續(xù)在試管中沉淀，記得要小心重懸細胞。

如果您的樣本只占據(jù)了培養(yǎng)板的一部分，那么請用培養(yǎng)基（每孔100ul）填滿周圍的孔，以減少在孵育過程中樣本的水分蒸發(fā)。

將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱: 在將細胞和刺激物加入培養(yǎng)板后，下一步就是將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中。一般來說，培養(yǎng)箱的溫度應(yīng)設(shè)置為37℃，二氧化碳濃度為5%。在孵育細胞時，需要注意以下兩點：①用鋁箔包裹培養(yǎng)板，盡管大多數(shù)培養(yǎng)箱能夠維持最佳的濕度水平，但用鋁箔包裹培養(yǎng)板是一種良好的實踐，可以降低細胞培養(yǎng)基蒸發(fā)的風(fēng)險。②將培養(yǎng)板并排放置，而不是堆疊放置。不要在培養(yǎng)箱中堆疊培養(yǎng)板。堆疊培養(yǎng)板可能會導(dǎo)致培養(yǎng)板之間出現(xiàn)不均勻的條件（例如，溫度、二氧化碳濃度、蒸發(fā)率等），這可能會對細胞產(chǎn)生影響，進而影響斑點數(shù)量。

3. 讓抗體捕獲分析物

與ELISA不同，ELISpot在孔底使用特異性捕獲抗體，在分泌后立即以及在整個刺激過程中捕獲細胞因子、免疫球蛋白或其他目標蛋白。這就是ELISpot如此靈敏的原因。當培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中時，您現(xiàn)在只需等待抗體捕獲分析物。需要注意的是：①不同分析物具有不同的動力學(xué)，在確定最佳細胞孵育時間時，要考慮蛋白質(zhì)分泌的動力學(xué)。有些分析物，如顆粒酶B，在刺激超過48小時后才完全分泌，而另一些分析物，如干擾素γ，僅需12小時后即可進行分析。②在孵育期間不得移動培養(yǎng)板，避免在孵育期間移動培養(yǎng)板，因為這可能會對斑點形成產(chǎn)生負面影響。即使是微小的移動也應(yīng)避免，因此要輕柔地關(guān)閉培養(yǎng)箱門。

4. 加入檢測抗體

在孵育步驟之后，細胞已經(jīng)響應(yīng)刺激而分泌了分析物，而分析物已被包被在培養(yǎng)板上的特異性抗體捕獲。現(xiàn)在是進行檢測的時候了。這可能顯而易見，但還是要說一下：在ELISpot實驗中，您檢測的是曾經(jīng)存在并分泌您正在研究的分析物的細胞的“足跡”。因此，首先需要將細胞洗掉：倒空培養(yǎng)板，并用PBS（每孔200微升）洗板5次。ELISpot基于一種酶促檢測系統(tǒng)。對于大多數(shù)試劑盒，檢測步驟是使用生物素化的檢測抗體，隨后使用與酶結(jié)合的鏈霉親和素來完成（“兩步檢測”）。然而，對于某些分析物，Mabtech提供了一種直接與酶結(jié)合的檢測抗體（“一步檢測”）。

兩步檢測: 檢測抗體與生物素結(jié)合，生物素是一種對鏈霉親和素具有高親和力的小分子。加入這種生物素化的檢測抗體是第一步。在第二步中，引入一種與檢測抗體上的生物素分子強烈結(jié)合的鏈霉親和素-酶結(jié)合物（見步驟5）。加入合適的底物完成斑點顯色（見步驟6）。由于每個檢測抗體上有多個生物素分子，而每個鏈霉親和素-酶結(jié)合物又有多個生物素結(jié)合位點，因此信號被放大。

一步檢測: 選擇直接與酶結(jié)合的檢測抗體可以減少實驗步驟的數(shù)量。這節(jié)省了時間，但與兩步檢測系統(tǒng)相比，信號放大程度較低。然而，靈敏度的差異很小，而且重要的是，稍微低一點的靈敏度對于某些實驗設(shè)置是有益的，因為它也可以降低背景信號。

5. 加入鏈霉親和素-酶綴合物

一旦生物素化的檢測抗體與分析物結(jié)合，就到了加入鏈霉親和素-酶綴合物的時候了。需要注意的是，如果檢測抗體是直接與酶結(jié)合的，您可以跳過這一步。

Mabtech使用的酶是堿性磷酸酶（ALP）或辣根過氧化物酶（HRP）。ALP和HRP催化不同的化學(xué)反應(yīng)，因此需要不同的底物。Mabtech推薦使用BCIP/NBT-plus(貨號3650-10)用于基于ALP的ELISpot，以及使用TMB(貨號3651-10)用于基于HRP的ELISpot試劑盒（更多細節(jié)見步驟6）。一般來說，您可以選擇使用ALP或HRP；這兩種酶都適用于大多數(shù)應(yīng)用。如果您是ELISpot領(lǐng)域的新人，Mabtech建議您選擇ALP。這是因為HRP/TMB反應(yīng)在某些實驗設(shè)置中非常迅速，因此更難在最佳時間點停止反應(yīng)。此外，BCIP/NBT-plus的斑點可以持久保留，而TMB的斑點則會隨著時間的推移而褪色。

6. 加底物

在ELISpot實驗中，底物需要能夠形成沉淀，即在被酶催化后沉淀到孔底。這種沉淀形成了我們所說的“斑點”。市場上有很多種沉淀型底物，但Mabtech推薦使用BCIP/NBT-plus(貨號3650-10)用于ALP，以及使用TMB(貨號3651-10)用于HRP。這兩種底物都具有很高的靈敏度，并且能夠產(chǎn)生清晰、容易評估的斑點。

在ELISpot實驗中，顯色時間取決于分析物、檢測抗體、酶結(jié)合物、所用底物以及分泌的分析物量等因素。如果您使用的不是Mabtech提供的試劑，可能需要對檢測抗體和鏈霉親和素-酶結(jié)合物進行梯度稀釋實驗，以找到最佳工作濃度。如果試劑由Mabtech提供，您可以直接按照試劑盒的說明書進行操作。一般來說，顯色至陽性對照孔中的斑點清晰可見即可。顯色時間因試劑和實驗條件不同而有所差異，但通常以分鐘計，而非小時。使用Mabtech的ELISpot Plus或ELISpot Pro試劑盒時，HRP-TMB反應(yīng)（2-10分鐘）比ALP-BCIP/NBT-plus反應(yīng)（3-15分鐘）更快。需要注意的是，過度顯色可能導(dǎo)致背景變暗，降低斑點對比度。因此，通過預(yù)實驗為每個項目、分析物和樣本類型找到最佳顯色時間是一個良好的實踐。

終止反應(yīng)的方法取決于您使用的是BCIP/NBT-plus還是TMB：

7. 斑點分析

在分析之前，培養(yǎng)板必須完全干燥。如果您不著急，可以將培養(yǎng)板放置一夜使其自然干燥。為了將干燥時間縮短到大約30分鐘，Mabtech通常將培養(yǎng)板倒置放在層流罩中。如果您使用的是帶有底部保護墊的MSIP培養(yǎng)板，在將其放入層流罩之前，請小心地拆卸底部的保護墊（例如，使用鉗子）。

雖然可以用光學(xué)顯微鏡分析ELISpot培養(yǎng)板，但為了節(jié)省大量時間并減少錯誤，Mabtech建議您使用酶聯(lián)免疫斑點讀板儀。在分析培養(yǎng)板時，重要的是要認識到，盡管讀板儀中有許多過程是自動化的，但您可以決定要計數(shù)哪些斑點。使用Mabtech Apex?軟件（適用于ASTOR和IRIS），默認的計數(shù)設(shè)置適用于大多數(shù)情況。

然而，類似于流式細胞術(shù)中對細胞群體進行分選，您可以使用大小和強度的設(shè)置來確定您認為相關(guān)的斑點。由于ELISpot非常靈敏，因此在陰性對照孔中出現(xiàn)斑點并不罕見。這是正常的！Mabtech強烈建議您不要從“真實”斑點中減去這些斑點，而是使用一種統(tǒng)計分析方法，將陰性對照孔中的斑點納入考慮，以判斷您是否觀察到陽性反應(yīng)。

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