文獻(xiàn)標(biāo)題：Gene signature predicting recurrence in oral squamous cell carcinoma is characterized by increased oxidative phosphorylation

DOI:10.1002/1878-0261.13328

研究背景：

口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）是最常見(jiàn)的口腔癌類型，占所有口腔癌的90%以上。在2020年，全球估計(jì)有430,000例新的OSCC診斷和約200,000例相關(guān)死亡。盡管手術(shù)和輔助放療化療有所改進(jìn)，OSCC的預(yù)后仍然較差，中位生存時(shí)間為37.6個(gè)月，5年生存率為64.4%。OSCC的不良預(yù)后包括局部侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。目前對(duì)OSCC復(fù)發(fā)機(jī)制的理解不足，缺乏有效的預(yù)后預(yù)測(cè)因子。腫瘤復(fù)發(fā)是癌癥治療失敗的主要原因，因此理解腫瘤復(fù)發(fā)的機(jī)制對(duì)于提高治療效果至關(guān)重要。系統(tǒng)方法，包括基因組學(xué)，是開(kāi)發(fā)更有效的癌癥預(yù)后和預(yù)測(cè)因子的關(guān)鍵。氧化磷酸化（OXPHOS）是一種代謝途徑，它在癌細(xì)胞的能量代謝中起作用。早期研究表明，與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞的糖酵解增加。然而，近期的研究表明，在某些癌癥中，包括乳腺癌、肺癌和急性髓系白血病（AML），OXPHOS增加，且OXPHOS是癌癥干細(xì)胞（CSCs）的首選能量產(chǎn)生過(guò)程。針對(duì)OXPHOS的治療可能抑制癌癥的惡性行為，因此，本研究旨在開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證一個(gè)新穎且強(qiáng)大的基因簽名，以預(yù)測(cè)OSCC的預(yù)后，并揭示導(dǎo)致治療失敗的惡性和進(jìn)展機(jī)制，以識(shí)別OSCC的治療策略。

研究?jī)?nèi)容：

本研究的核心內(nèi)容是開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證用于預(yù)測(cè)口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）患者預(yù)后的基因簽名，并探索與OSCC復(fù)發(fā)相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)Cox回歸分析識(shí)別出一個(gè)與OSCC復(fù)發(fā)相關(guān)的基因簽名（ORGS），并通過(guò)功能富集分析揭示了ORGS背后的生物學(xué)途徑和過(guò)程。特別地，研究發(fā)現(xiàn)氧化磷酸化（OXPHOS）信號(hào)通路與ORGS相關(guān)，并且與OSCC患者的總體生存率差有強(qiáng)烈的關(guān)聯(lián)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)中介體復(fù)合物亞單位30（MED30）是OXPHOS的上游調(diào)控因子，其敲低可以減少組蛋白乙酰化，影響OXPHOS基因的表達(dá)，進(jìn)而影響OSCC的預(yù)后。

研究方法：

1. 數(shù)據(jù)收集：研究者從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載了OSCC患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床信息，包括20530個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)和520個(gè)HNSCC患者的臨床信息。

2. 基因簽名開(kāi)發(fā)：使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，研究者確定了210個(gè)基因作為OSCC復(fù)發(fā)相關(guān)的基因簽名（ORGS），其中包括123個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)基因和87個(gè)低風(fēng)險(xiǎn)基因。

3. 功能富集分析：通過(guò)基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析，研究者分析了ORGS相關(guān)的功能和途徑。 

4. 獨(dú)立隊(duì)列驗(yàn)證：研究者在兩個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)集（FHCRC和KHU）中驗(yàn)證了基因表達(dá)簽名，使用支持向量機(jī)（SVM）算法來(lái)分類患者。

5. 上游調(diào)控因子分析：使用INGENUITY PATHWAY ANALYSIS（IPA）軟件，研究者進(jìn)行了上游調(diào)控因子分析，以識(shí)別OXPHOS基因的上游調(diào)控因子。

6. 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：研究者對(duì)人類OSCC細(xì)胞系HSC3和HSC4進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行了siRNA轉(zhuǎn)染以沉默MED30基因。

7. 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：包括實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）、西方印跡分析（Western blotting）、線粒體膜電位（MMP）檢測(cè)、活性氧（ROS）生成檢測(cè)和凋亡分析等實(shí)驗(yàn)，以探究MED30對(duì)OXPHOS基因表達(dá)和OSCC細(xì)胞功能的影響。

結(jié)果討論：

ORGS成功將OSCC患者分為低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)兩組，兩組的總體生存率有顯著差異，通路分析顯示OXPHOS與ORGS在OSCC中相關(guān)，且高OXPHOS狀態(tài)與OSCC患者預(yù)后差強(qiáng)相關(guān)。MED30作為OXPHOS的預(yù)測(cè)上游調(diào)控因子，其敲低可以減少組蛋白乙酰化；ORGS與OXPHOS調(diào)節(jié)過(guò)程強(qiáng)烈相關(guān)，表明OXPHOS是導(dǎo)致OSCC預(yù)后不良的關(guān)鍵機(jī)制。研究還發(fā)現(xiàn)MED30敲低會(huì)增加ROS生成并誘導(dǎo)凋亡，暗示MED30敲低可能通過(guò)ROS生成誘導(dǎo)凋亡。綜上所述，這項(xiàng)研究不僅開(kāi)發(fā)了一個(gè)新的基因簽名ORGS來(lái)預(yù)測(cè)OSCC的復(fù)發(fā)，還揭示了OXPHOS和MED30在OSCC中的重要作用，為OSCC的治療提供了新的靶點(diǎn)。

MITO-ID Membrane potential detection kit（貨號(hào)：ENZ-51018）：Enzo的MITO-ID?膜電位檢測(cè)試劑盒使用簡(jiǎn)單的混合讀取，無(wú)清洗協(xié)議監(jiān)測(cè)能量狀態(tài)。它包括一個(gè)雙發(fā)射陽(yáng)離子染料來(lái)測(cè)量活細(xì)胞中的線粒體膜電位（MMP）。

值得注意的產(chǎn)品亮點(diǎn)包括：

?靈敏度比JC-1 （Invitrogen）高10倍，水溶性好；

?活細(xì)胞的真正混合-讀取均質(zhì)試驗(yàn)；

?優(yōu)化了熒光顯微鏡，流式細(xì)胞術(shù)，微孔板閱讀器，和高應(yīng)用程序吞吐量；

在文獻(xiàn)中，MITO-ID? Membrane Potential Detection Kit?的主要應(yīng)用是檢測(cè)活細(xì)胞中的線粒體膜電位（Mitochondrial Membrane Potential, MMP）。以下是其具體應(yīng)用的詳細(xì)描述：

1．線粒體膜電位的測(cè)定：MITO-ID? Membrane Potential Detection Kit包含一種雙發(fā)射陽(yáng)離子染料，用于測(cè)定活細(xì)胞中的線粒體膜電位（MMP）。在有能量或活躍的細(xì)胞中，MITO-ID? 膜電位試劑因其相對(duì)負(fù)電荷而在線粒體中迅速聚集成發(fā)橙色熒光的聚合體，而在細(xì)胞質(zhì)中則以發(fā)綠色熒光的單體存在。

2．細(xì)胞健康和凋亡的評(píng)估：線粒體膜電位的喪失通常與細(xì)胞凋亡的早期階段有關(guān)。因此，MITO-ID?試劑盒可以作為評(píng)估細(xì)胞健康程度、線粒體膜通透性和細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要工具。

3．藥物誘導(dǎo)毒性和細(xì)胞凋亡研究：評(píng)估線粒體功能狀態(tài)的基于細(xì)胞的檢測(cè)方法正在成為闡明線粒體活動(dòng)在藥物誘導(dǎo)毒性、細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)以及其他細(xì)胞和生化過(guò)程中的作用的有用工具。

4．熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用：MITO-ID? Membrane Potential Detection Kit優(yōu)化了用于熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)的線粒體膜電位（MMP）和細(xì)胞活性的測(cè)量。在熒光顯微鏡下，MITO-ID?膜電位染料是雙發(fā)射探針，在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)出綠色熒光，在線粒體中發(fā)出橙色熒光。當(dāng)添加像CCCP這樣的擾動(dòng)藥物時(shí)，染料主要以綠色熒光單體存在于細(xì)胞質(zhì)中，在線粒體中不再表現(xiàn)出橙色熒光。

5．高通量應(yīng)用：該試劑盒適合于高通量應(yīng)用，包括化學(xué)/環(huán)境毒性篩選，無(wú)需洗滌步驟，是一個(gè)真正的混合即讀均質(zhì)測(cè)定法，適用于活細(xì)胞。

綜上所述，MITO-ID? Membrane Potential Detection Kit?在文獻(xiàn)中主要應(yīng)用于測(cè)定活細(xì)胞中的線粒體膜電位，評(píng)估細(xì)胞健康和凋亡，以及在藥物毒性和細(xì)胞凋亡研究中的應(yīng)用