酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）是一種基于抗體的技術(shù)，用于檢測和定量溶液中的目標(biāo)分析物。這些目標(biāo)通常是蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞因子、趨化因子、免疫球蛋白、激素以及其他生物標(biāo)志物。

ELISA的設(shè)置包括直接/間接（先抗原）、競爭性和夾心ELISA。在這里，我們重點(diǎn)關(guān)注夾心ELISA。它不僅因?yàn)橥ǔ＞哂械捅尘靶盘?hào)而成為我們的首選，還因?yàn)閵A心ELISA通常通過匹配的抗體對(duì)增加了特異性。夾心ELISA包括捕獲抗體和檢測抗體，即所謂的抗體對(duì)，它們識(shí)別相同的目標(biāo)分析物，但針對(duì)不同的表位。這種檢測方法與三明治的形象類似，抗原被視為夾在兩片面包之間的美味部分（就像奶酪或果醬），在ELISA中則是夾在兩片抗體之間。這種生物分子三明治是檢測的核心。為了定量反應(yīng)，檢測抗體要么直接標(biāo)記，要么在檢測中包含一個(gè)二級(jí)檢測步驟。最后，加入一種可溶性底物，產(chǎn)生的顏色與結(jié)合的分析物量成正比。

夾心elisa流程示意圖：

1. 包被捕獲抗體：將捕獲的抗體在PBS中稀釋到推薦的工作濃度(Mabtech的ELISA Flex試劑盒的典型包被濃度為2 ug/ml)。每孔加100ul包被ELISA 96孔板(通常由聚苯乙烯制成，通過疏水結(jié)合來結(jié)合蛋白質(zhì))，在4-8℃下孵育過夜。(備注：如果您選擇Mabtech的ELISA Pro試劑盒，則無需考慮包被步驟，因?yàn)榘逡杨A(yù)先包被)

2. 封閉：去掉板中的液體，每孔加入200 ul含有0.05% Tween 20和0.1% BSA的PBS（孵育緩沖液）以封閉板，在室溫下孵育1小時(shí)。備注：牛血清白蛋白（BSA）的封閉能力得到了充分證實(shí)，因此BSA作為一種蛋白封閉劑非常受歡迎。吐溫20是一種非離子型封閉洗滌劑，但它屬于易被水溶液洗脫的臨時(shí)性封閉劑。因此，吐溫被包含在封閉緩沖液中作為次要的封閉試劑。此外，如果將其添加到洗滌緩沖液中，吐溫可以促進(jìn)弱結(jié)合分子的解離，并在后續(xù)步驟中封閉新暴露的結(jié)合位點(diǎn)，從而進(jìn)一步減少非特異性信號(hào)。

3. 洗板：用含0.05% Tween 20（每孔300 ul）的PBS洗滌5次。備注：洗滌步驟完成后，將板在吸水紙上輕拍以去除所有洗滌緩沖液。立即進(jìn)行檢測的下一步（不要讓板晾干）。

4. 加標(biāo)準(zhǔn)品或者樣本：每孔加入100 ul用孵育緩沖液或ELISA稀釋液稀釋的樣本或標(biāo)準(zhǔn)品(設(shè)置背景對(duì)照，例如不含標(biāo)準(zhǔn)品的孔)，在室溫下孵育2小時(shí)。按上述方法洗板。備注：所有樣本至少應(yīng)在所選的ELISA稀釋緩沖液中稀釋2倍。所有樣本制備和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋均應(yīng)使用相同的緩沖液。選擇哪種緩沖液取決于樣本類型。Mabtech推薦細(xì)胞培養(yǎng)上清用孵育緩沖液（含0.05% Tween 20和0.1% BSA的PBS），血漿和血清樣品用ELISA稀釋液。如果您不知道樣本應(yīng)該如何稀釋以獲得在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)的結(jié)果，Mabtech為您提供了一個(gè)ELISA樣本稀釋建議（下圖）。這個(gè)建議涵蓋了2倍、20倍和200倍的三種稀釋范圍。在選定的ELISA稀釋緩沖液（孵育緩沖液或ELISA稀釋液）中稀釋樣本。

5. 加入檢測抗體：在孵育緩沖液或ELISA稀釋液中稀釋生物素化標(biāo)記單抗至推薦工作濃度。每孔加入100 ul，室溫孵育1小時(shí)。按照上面的方法洗板。備注：根據(jù)檢測抗體的標(biāo)記類型，分為一步法和兩步法，一步法是抗體直接標(biāo)記酶，兩步法使用標(biāo)記了生物素的檢測抗體，在隨后的步驟中，鏈霉親和素會(huì)以極高的特異性與這些生物素分子結(jié)合。一般來說，兩步檢測被認(rèn)為更靈敏，因?yàn)樾盘?hào)得到了放大。

6. 加入鏈霉親和素-酶標(biāo)記物：在孵育緩沖液中每孔加入稀釋1:1000的鏈霉親和素酶偶聯(lián)物100ul。室溫孵育1小時(shí)。按照上面的方法洗板。備注：在Mabtech，提供兩種不同的鏈親和素酶偶聯(lián)物：鏈親和素- HRP（SA-HRP）和鏈親和素-ALP（SA-ALP）。與HRP反應(yīng)相比，ALP反應(yīng)更慢，但活性更呈線性。使用ALP時(shí)，您可以進(jìn)行連續(xù)讀數(shù)，以捕捉到最佳讀數(shù)時(shí)間點(diǎn)，這在某些情況下可能很有幫助。與HRP不同，ALP不受疊氮化鈉或其他抗菌劑的影響。但ALP可能會(huì)被半胱氨酸、氰化物、砷酸鹽、無機(jī)磷酸鹽以及螯合二價(jià)陽離子的化合物（如EDTA）抑制。

7. 加底物：每孔加入100 ul底物，包括空白孔。將板置于室溫下，避光孵育。如果使用鏈霉親和素-辣根過氧化物酶（SA-HRP）：使用TMB底物（最好是冷的）,孵育15分鐘。如果使用鏈霉親和素-堿性磷酸酶（SA-ALP）：使用pNPP底物，孵育大約60分鐘，在顯色過程中可以在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)讀取板。

8. 加終止液：如果使用鏈霉親和素-辣根過氧化物酶（SA-HRP）+TMB：每孔加入100 ul 0.2 M H2SO4終止反應(yīng)。備注：如果使用鏈霉親和素-辣根過氧化物酶（SA-HRP）+TMB，加入硫酸（H2SO4）將終止顯色反應(yīng)。通常的孵育時(shí)間是15分鐘，如果觀察到反應(yīng)速度很快，可以將孵育時(shí)間縮短至5分鐘。由于pH值變化劇烈，酶被失活，從而停止進(jìn)一步催化顯色反應(yīng)。TMB最初呈藍(lán)色，加入硫酸后會(huì)變成黃色。在這一步中，您不僅終止了反應(yīng)，而且生成的衍生物更穩(wěn)定，吸光度也更高。

9. 讀板：如果使用鏈霉親和素-辣根過氧化物酶（SA-HRP）+TMB：在15分鐘內(nèi)使用ELISA讀板儀在450 nm處測量吸光度，最好使用能夠減去650 nm參考波長的讀板儀。如果使用鏈霉親和素-堿性磷酸酶（SA-ALP）+pNPP：在ELISA讀板儀上于405 nm處測量吸光度。可以在之后進(jìn)行多次讀數(shù)，例如在30分鐘、60分鐘和90分鐘時(shí)，最好使用能夠減去650 nm參考波長的讀板儀。

作為高品質(zhì)ELISA試劑盒供應(yīng)商，mabtech可提供三種版本的elisa試劑盒：