研究特定基因的甲基化狀態(tài)，可采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化法或甲基化DNA富集法。

1. 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化

為了評估特定基因的甲基化狀態(tài)，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化通常是第一步，然后進行多種下游應用。在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過程中，DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉處理，未甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶對這種處理不敏感，仍保持為胞嘧啶。在DNA擴增過程中，尿嘧啶被識別為胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶仍保持為胞嘧啶。這使得可以區(qū)分胞嘧啶的甲基化狀態(tài)。

在亞硫酸氫鹽處理后，用于特定基因DNA甲基化分析的常見下游方法包括亞硫酸氫鹽測序和甲基化特異性PCR（MS-PCR）。根據(jù)下游應用的不同，可以確定最適合的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化方法，尤其是由于轉(zhuǎn)化后片段大小的差異。DNA修飾試劑盒（貨號P-1026）專門針對實時MS-PCR，而 DNA修飾試劑盒(貨號P-1001)則設計為與Illumina工作流程和下一代測序（NGS）兼容。對于含有低量DNA的樣本，建議使用全細胞亞硫酸氫鹽修飾試劑盒(貨號P-1016)，因為它可以直接從細胞、組織、血液和其他起始材料進行轉(zhuǎn)化。在處理大規(guī)模亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化實驗時，高通量選項至關(guān)重要，以節(jié)省時間和降低成本，在這種情況下，DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化磁珠-96試劑盒（貨號P-1008）專門針對高通量，采用基于磁珠的96孔格式。

1.1 亞硫酸氫鹽測序（甲基化測序）

亞硫酸氫鹽DNA轉(zhuǎn)化與測序相結(jié)合（亞硫酸氫鹽測序）是DNA甲基化研究的金標準，因為它可以提供特定基因的單堿基分辨率信息，明確每個單獨胞嘧啶的甲基化狀態(tài)。在測序過程中，未甲基化的胞嘧啶會被讀作胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則被讀作胞嘧啶，從而能夠區(qū)分胞嘧啶的甲基化狀態(tài)。亞硫酸氫鹽測序可以在全基因組范圍內(nèi)進行，也可以更有針對性地針對特定基因開展。

使用亞硫酸氫鹽處理后DNA文庫制備試劑盒（貨號P-1055），可以直接從亞硫酸氫鹽處理后的DNA構(gòu)建與Illumina兼容的文庫，用于甲基化測序。在成功完成亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后，為基于各種Illumina平臺的亞硫酸氫鹽測序（亞硫酸氫鹽測序）檢測準備DNA文庫，例如全基因組亞硫酸氫鹽測序（WGBS）、氧化亞硫酸氫鹽測序（oxBs-seq）、簡化表示亞硫酸氫鹽測序（RRBS）以及其他基于亞硫酸氫鹽的下一代測序應用。

對于從低輸入量DNA進行簡化流程的亞硫酸氫鹽測序NGS文庫制備，可以使用高靈敏度亞硫酸氫鹽測序試劑盒（貨號P-1056A）。該試劑盒旨在將DNA進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，并為基于Illumina的亞硫酸氫鹽測序準備文庫，所有步驟都包含在一個試劑盒中。

1.2 甲基化特異性PCR（MSP）

亞硫酸氫鹽DNA轉(zhuǎn)化與定量PCR相結(jié)合（甲基化特異性PCR）能夠?qū)μ囟―NA區(qū)域的甲基化狀態(tài)進行特定基因的評估。然而，它無法提供正在檢測區(qū)域內(nèi)每個單獨胞嘧啶位點的信息。通常情況下，這是一種有力的技術(shù)，用于驗證通過亞硫酸氫鹽測序獲得的甲基化結(jié)果，也是一種較為省力且成本效益較高的技術(shù)，可用于同時評估多個樣本中感興趣基因的甲基化狀態(tài)。可使用MS-qPCR快速試劑盒（貨號P-1028）進行快速、特異且靈敏的甲基化特異性定量PCR

2. 富集甲基化DNA（meDIP或MBD）

基于親和力的富集甲基化DNA的方法，如甲基化DNA免疫沉淀（meDIP）或甲基化CpG結(jié)合域（MBD），是不依賴于DNA亞硫酸氫鹽處理的替代技術(shù)。

2.1 甲基化DNA免疫沉淀（meDIP）

通過使用針對5-甲基胞嘧啶（5-mC）特異性的抗體進行免疫沉淀來富集甲基化DNA，從而評估基因組中特定基因或區(qū)域的甲基化狀態(tài)（meDIP）。該技術(shù)無需通過亞硫酸氫鹽處理對DNA進行修飾。獲得的甲基化DNA隨后可以通過NGS進行測序（meDIP-Seq），或者通過qPCR進行分析（meDIP-PCR）。MeDIP試劑盒（貨號P-1052）可用于高效富集和捕獲甲基化DNA片段。與無法區(qū)分5-mC和5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）的亞硫酸氫鹽測序不同，該技術(shù)還可用于5-hmC的免疫沉淀，hMeDIP試劑盒（貨號P-1038）。

2.2甲基化CpG結(jié)合域蛋白（MBD）

甲基化DNA還可以通過MBD蛋白進行捕獲富集。MBD蛋白能夠結(jié)合甲基化DNA，尤其偏好CpG二核苷酸，并通過招募額外的蛋白復合體來介導基因沉默。EpiGentek提供用于細胞系樣本的甲基-CpG結(jié)合域蛋白2（MBD2 ） ChIP試劑盒（貨號P-2017），基于使用針對MBD2特異性的抗體進行MBD捕獲，以實現(xiàn)甲基化DNA的染色質(zhì)免疫沉淀。