多組氨酸或His 6標簽是一種蛋白質(zhì)標簽，最初于1988年開發(fā)，用于高效純化蛋白質(zhì)而開發(fā)的蛋白標簽。由于其相對較高性價比，它被認為是迄今為止最廣泛使用的蛋白質(zhì)親和標簽之一。由于其小尺寸，可在四到十個氨基酸之間變化，His很少干擾目標蛋白質(zhì)的功能。此外，其低免疫原性和在天然及變性條件下的多功能性，使這種蛋白質(zhì)標簽在眾多標簽中脫穎而出。His標簽的底層純化原理是金屬離子與組氨酸的咪唑環(huán)之間的相互作用。

通過His標簽對蛋白質(zhì)進行純化是通過不同的二價金屬離子（如Ni2+，這是最常用的離子）與組氨酸的基本咪唑環(huán)之間的相互作用來實現(xiàn)的。His標簽能夠在中性到略微堿性的pH值（7.5至8是典型的）下與這些金屬離子結(jié)合。值得注意的是，這兩種相互作用伙伴之間的結(jié)合親和力與His標簽的長度成正比。與His6標簽相比，His10標簽能夠?qū)崿F(xiàn)十倍的結(jié)合親和力。然而，作為首次嘗試，建議盡量減少組氨酸殘基的數(shù)量，以避免可能對蛋白質(zhì)功能造成干擾。在純化過程的后期階段，可以通過將pH值降低到4-5來洗脫蛋白質(zhì)，盡管應(yīng)該注意到有些蛋白質(zhì)在這樣的低pH值下會發(fā)生變性。此外，大多數(shù)科學家更傾向于通過更高濃度的咪唑（100-500 mM）進行競爭性洗脫。還建議在裝載和洗滌緩沖液中加入低摩爾濃度的咪唑（5-20 mM，很少達到80 mM），以減少非特異性結(jié)合事件，因為一些內(nèi)源性蛋白質(zhì)或天然存在的組氨酸能夠?qū)MAC樹脂顯示出微弱的結(jié)合。每種蛋白質(zhì)的最佳條件應(yīng)始終單獨確定。

親和純化步驟

1. 結(jié)合：含有His標簽蛋白質(zhì)的粗溶液被加到柱子上，并基于親和標簽-基質(zhì)相互作用進行結(jié)合。

2. 洗滌：其他非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)被適當?shù)南礈炀彌_液沖走。這些緩沖液中應(yīng)該已經(jīng)含有低摩爾濃度的咪唑。

3. 洗脫： 特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)從柱子上洗脫，通常是通過類似分子的競爭性結(jié)合（例如組氨酸和咪唑）、通過蛋白酶切割標簽，或者通過改變pH值破壞親和標簽-基質(zhì)相互作用來實現(xiàn)。然后可以將純化的洗脫液收集到反應(yīng)管中，以供進一步研究。

通過His標簽的蛋白質(zhì)純化通常是通過固定金屬親和色譜法（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）實現(xiàn)的。這是一種廣泛使用的純化方法，用于從溶液中分離對金屬離子（如Ni2+或Co2+）具有親和力的蛋白質(zhì)和肽段。對蛋白質(zhì)進行His標簽化，可以使新形成的融合蛋白與螯合金屬結(jié)合，從而在很少的步驟中實現(xiàn)大量的富集。常用的螯合劑作為配體是IDA和NTA瓊脂糖樹脂。它們可以很容易地與二價金屬配對，這取決于所需過程的親和力/特異性比率。

三種配體（IDA，NTA&INDIGO-Ni）及其鎳結(jié)合能力的比較

選擇正確的His標簽純化樹脂或磁珠的類型基于三個因素：

配體：這是金屬離子在螯合物復合物中與之結(jié)合的分子。Cube Biotech可提供三種不同的配體。

NTA：氨三乙酸是最常用的配體。

IDA：亞氨基二乙酸是第二常用的配體。NTA對比IDA:IDA樹脂價格較低；NTA樹脂能得到純度更高的蛋白；NTA樹脂的金屬離子脫落量明顯較少；NTA樹脂對還原劑和螯合劑有更強的抵抗力。

INDIGO：這種配體是在Cube Biotech開發(fā)的。它的優(yōu)勢之一是大大提高了DTT和EDTA的耐受性。這種新型INDIGO配體裝載鎳離子。使用INDIGO配體，使得在高達20 mM DTT和20 mM EDTA的高蛋白質(zhì)容量下純化his標記的蛋白質(zhì)成為可能。

耦合的金屬離子：根據(jù)與配體耦合的金屬離子，His標簽純化的親和力和特異性會發(fā)生變化。銅具有最高的親和力，但同時具有最低的特異性。鈷則位于光譜的另一端。鎳是最常用的金屬離子，它在親和力和特異性之間取得了良好的平衡。經(jīng)驗法則：蛋白質(zhì)產(chǎn)量越高，純化過程的特異性就越低。

珠子的大小：使用的珠子直徑越大，F(xiàn)PLC純化的流速越高。這使它們更適合粘稠的細胞介質(zhì)或批量純化。然而，通常使用較慢的流速可以增加蛋白質(zhì)產(chǎn)量，因為較小的珠子具有更高的表面積與體積比。因此，相同體積的樹脂可以比更大尺寸的珠子結(jié)合更多的蛋白質(zhì)。Cube Biotech提供的珠子直徑有30微米、40微米、100微米和XL尺寸（約400微米）。

Cube Biotech 作為蛋白純化的專業(yè)供應(yīng)商可提供His標簽蛋白純化的樹脂、填料和試劑盒：

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