解析文章：《Protein Array-Based Detection of Proteins in Kidney Tissues from Patients with Membranous Nephropathy》

鏈接：https://doi.org/10.1155/2017/7843584

背景

膜性腎病（Membranous Nephropathy, MN）是一種自身免疫性炎癥疾病，主要表現(xiàn)為腎小球基底膜（Glomerular Basement Membrane, GBM）增厚，是成年人腎病綜合征的主要原因之一，占終末期腎病（End Stage Renal Disease, ESRD）病例的20%至40%。MN的病理特征是GBM下免疫復(fù)合物IgG和C3的沉積導(dǎo)致GBM增厚。盡管已知自身抗體和補(bǔ)體在MN的發(fā)展和進(jìn)展中起重要作用，但涉及GBM增厚的具體途徑仍不清楚。蛋白質(zhì)作為細(xì)胞功能的執(zhí)行者，可能參與了MN的整個發(fā)病過程。然而，大規(guī)模篩選腎臟蛋白質(zhì)并進(jìn)行功能分析的研究仍較為罕見。蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)因其能夠高通量篩選數(shù)千種蛋白質(zhì)而成為一種先進(jìn)的蛋白質(zhì)研究技術(shù)，相比質(zhì)譜和其他傳統(tǒng)方法（如蛋白質(zhì)印跡和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）具有更高的效率和更小的樣本需求。

方法

樣本收集

本研究獲得了中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，并遵循《赫爾辛基宣言》及其后續(xù)修正案或可比的倫理標(biāo)準(zhǔn)。所有樣本均來自中國人民解放軍總醫(yī)院腎病科。研究共納入了15個腎臟樣本，其中6個來自特發(fā)性MN患者，9個來自腎細(xì)胞癌（Renal Cell Carcinoma, RCC）患者的正常腎臟組織作為對照。MN患者均通過腎活檢病理明確診斷為特發(fā)性MN，并排除了自身免疫性疾病、感染、糖尿病和高血壓等其他疾病。

蛋白質(zhì)提取

新鮮樣本收集后，立即用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌以去除雜質(zhì)和血液。通過離心去除上清液，重復(fù)此過程直至組織幾乎無色。然后按照制造商的說明將組織解離并裂解。裂解液離心后，使用BCA法測定上清液中的蛋白質(zhì)濃度，并將樣品稀釋至所需濃度。

蛋白質(zhì)微陣列檢測

本研究選擇了三種蛋白質(zhì)芯片來比較它們在檢測腎臟組織中蛋白質(zhì)水平的性能：定量蛋白質(zhì)芯片Quantibody 5 Human Inflammation Array 3（QAH-INF-3）和兩種半定量L系列抗體芯片L-507和L-493。QAH-INF-3是一種基于多重夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的定量陣列平臺，能夠準(zhǔn)確同時(shí)檢測40種蛋白質(zhì)的濃度。L-507和L-493分別基于生物素標(biāo)記和激光熒光掃描技術(shù)，可分別檢測507和493種蛋白質(zhì)。對于檢測，單個組織樣本分別使用12.5μg和6.25μg的樣品進(jìn)行QAH-INF-3檢測，使用50μg和25μg的樣品進(jìn)行L-507和L-493檢測。蛋白質(zhì)雜交按照各自制造商的說明進(jìn)行，熒光圖像使用Axon GenePix掃描，數(shù)據(jù)使用GenePix Pro 6.0軟件進(jìn)行分析。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證結(jié)果，選擇了EpCAM-1、CTSD和ADAMTS-4作為確認(rèn)標(biāo)記，并使用ELISA試劑盒測量MN和正常對照的組織裂解物。此外，還進(jìn)行了免疫組織化學(xué)驗(yàn)證，以避免組織裂解物中跨膜蛋白質(zhì)的假過表達(dá)。

統(tǒng)計(jì)分析

使用Student's t檢驗(yàn)處理定量數(shù)據(jù)，差異表達(dá)的蛋白質(zhì)（Differentially Expressed Proteins, DEPs）定義為MN/N比值大于1.4且P值小于0.05的蛋白質(zhì)。使用DAVID v6.8 Beta進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology, GO）分析，使用STRING v10進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）分析。

實(shí)驗(yàn)

RayBiotech品牌人體炎癥陣列Q3（貨號：QAH-INF-3）的作用和價(jià)值

在本研究中，RayBiotech品牌的人體炎癥陣列Q3被用作定量蛋白質(zhì)芯片之一，以評估其在檢測腎臟組織中蛋白質(zhì)水平的性能。人體炎癥陣列Q3是一種基于多重夾心ELISA的定量陣列平臺，具有以下特點(diǎn)和價(jià)值：

高通量檢測：人體炎癥陣列Q3能夠同時(shí)檢測40種不同的蛋白質(zhì)，相比傳統(tǒng)方法如單個ELISA或蛋白質(zhì)印跡，大大提高了檢測效率。這對于需要同時(shí)分析多種蛋白質(zhì)的研究尤其有價(jià)值，如本研究中對MN相關(guān)蛋白質(zhì)的篩選。

準(zhǔn)確性：通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，人體炎癥陣列Q3能夠準(zhǔn)確測量蛋白質(zhì)的濃度。這對于定量研究至關(guān)重要，有助于確定蛋白質(zhì)在疾病狀態(tài)下的表達(dá)變化。

易用性：人體炎癥陣列Q3的使用相對簡單，按照制造商的說明進(jìn)行操作即可。這降低了技術(shù)難度，使得更多研究人員能夠輕松使用該平臺進(jìn)行研究。

重復(fù)性：盡管在本研究中人體炎癥陣列Q3未被選為最適合檢測腎臟組織蛋白質(zhì)的芯片，但其良好的重復(fù)性是值得肯定的。這對于需要多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)以確保結(jié)果可靠性的研究尤為重要。

然而，在本研究中，人體炎癥陣列Q3在檢測腎臟組織蛋白質(zhì)方面的性能并未達(dá)到預(yù)期。熒光圖像、標(biāo)準(zhǔn)曲線和散點(diǎn)圖分析顯示，只有22.5%的信號強(qiáng)度比值在1.3至2.0之間，遠(yuǎn)低于理論比值。這表明QAH-INF-3在檢測腎臟組織蛋白質(zhì)時(shí)可能受到某些因素的限制，如抗體質(zhì)量、樣本處理或芯片設(shè)計(jì)等。因此，盡管QAH-INF-3具有高通量、準(zhǔn)確性和易用性等優(yōu)點(diǎn)，但在特定應(yīng)用中仍需考慮其適用性和局限性。

相比之下，L-493芯片在檢測腎臟組織蛋白質(zhì)方面表現(xiàn)出更好的性能。L-493能夠檢測更多可用的蛋白質(zhì)（214種，占43.41%），且信號強(qiáng)度比值更接近理論值。因此，L-493被選為最適合檢測腎臟組織蛋白質(zhì)的芯片，并用于后續(xù)MN相關(guān)蛋白質(zhì)的篩選和分析。

DEPs的篩選和分析

使用L-493芯片對MN患者和正常對照的腎臟組織進(jìn)行了大規(guī)模蛋白質(zhì)篩選。結(jié)果顯示，L-493共鑒定出66種DEPs，這些蛋白質(zhì)在MN中均上調(diào)。GO分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)涉及多個與MN發(fā)病相關(guān)的生物過程，包括細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix, ECM）解體和組織、細(xì)胞粘附、細(xì)胞-細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過程和免疫反應(yīng)。

更重要的是，基于PPI分析構(gòu)建了一個分子網(wǎng)絡(luò)，揭示了這些蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)分析顯示，多種蛋白質(zhì)如EpCAM、FER、SYK、CDH1、KRT8、KRT19和KRT18與細(xì)胞粘附相關(guān)；激素如POMC、IAPP、PTHLH和ACE與細(xì)胞代謝相關(guān)；CXCL5、CCR7、CD55和CD46與免疫激活相關(guān)；TF、FN1、ADAMTS4、APCS、CTSD和MMP13與ECM重塑相關(guān)。這些蛋白質(zhì)通過相互作用的蛋白質(zhì)連接成一個完整的功能區(qū)。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證微陣列結(jié)果，選擇了EpCAM、CTSD和ADAMTS-4作為確認(rèn)標(biāo)記，并使用ELISA和免疫組織化學(xué)進(jìn)行了驗(yàn)證。ELISA結(jié)果顯示，這些蛋白質(zhì)在MN組織中的表達(dá)水平顯著高于正常對照組織，與微陣列結(jié)果一致。免疫組織化學(xué)也顯示CTSD和CD46在MN中過表達(dá)。這些驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步支持了微陣列結(jié)果的可靠性。

結(jié)論

本研究使用蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)篩選了MN患者腎臟組織中的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并確定了多個可能與MN發(fā)病相關(guān)的途徑。盡管QAH-INF-3芯片在本研究中未表現(xiàn)出最佳性能，但其高通量、準(zhǔn)確性和易用性等特點(diǎn)仍使其在蛋白質(zhì)研究中具有重要價(jià)值。未來研究可進(jìn)一步探索這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)在MN發(fā)病中的具體作用機(jī)制，并考慮使用更大規(guī)模的樣本和多種疾病組進(jìn)行比較分析，以更全面地揭示MN的發(fā)病機(jī)理。