自 2016 - 2017 年有關(guān)利用干細(xì)胞培養(yǎng)出中腦類器官的早期研究論文發(fā)表以來(lái)，研究團(tuán)隊(duì)一直致力于證明這些三維微組織中存在具有功能性的多巴胺能神經(jīng)元。多巴胺能功能的一個(gè)廣受認(rèn)可且被普遍接受的標(biāo)志物是酪氨酸羥化酶（TH）——這種酶能將 L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為 L-多巴，而后者是多巴胺的前體物質(zhì)。

然而，TH 的表達(dá)并不一定意味著神經(jīng)元處于活躍代謝狀態(tài)并產(chǎn)生多巴胺。因此，一些對(duì)基于器官體模型研究帕金森病感興趣的團(tuán)隊(duì)將多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志物（如 TH 和 GIRK2）與使用抗半抗原抗體Dopamine Antibody – Rabbit Polyclonal（貨號(hào)：IS1005）直接對(duì)多巴胺進(jìn)行染色，以及用于定量分析上清液中多巴胺釋放的 ELISA 試劑盒Dopamine ELISA kit – Any sample（貨號(hào)：BA-E-5300R）相結(jié)合。

五篇展示人類中腦組織培養(yǎng)物中多巴胺合成過程的精選文章

1.這篇具有重要開創(chuàng)意義的論文（引用次數(shù)超過 350 次）描述了人類神經(jīng)上皮干細(xì)胞在第 50 天后向中腦特異性組織體的三維分化過程，其中包含能產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)元。

2017 年，來(lái)自盧森堡系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)中心（LCSB）的詹斯·施瓦姆邦恩團(tuán)隊(duì)發(fā)布了首個(gè)生成干細(xì)胞衍生中腦組織體的方案。該團(tuán)隊(duì)在分化后第 50 天證明了存在中腦特異性的多巴胺能神經(jīng)元，使用了諸如 TH、TUJ1、GIRK2、CALBINDIN、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體以及多巴胺本身等標(biāo)志物，并使用 IS1005 抗體進(jìn)行檢測(cè)。

[1] Monzel et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 2017 May 9;8(5):1144-1154. doi: 10.1016/j.stemcr.2017.03.010. Epub 2017 Apr 13.

2.在第 70 天后對(duì)中腦組織胚體進(jìn)行 TH 和多巴胺的全組織染色，并對(duì)多巴胺釋放量進(jìn)行定量分析

2019 年，施瓦姆伯恩小組與來(lái)自馬克斯·普朗克研究所和漢諾威醫(yī)學(xué)院的同事合作，發(fā)表了一種用于生成中腦組織胚體的替代方案（引用次數(shù)超過 200 次），該方案始于從誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）中分離出的中腦底板神經(jīng)祖細(xì)胞（mfNPCs）。他們通過 TH 和多巴胺的共染色證明了 70 天后存在產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)元，并且通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定ELISA（貨號(hào)：BA-E-5300R）測(cè)量到多巴胺釋放量在分化過程中的顯著增加（第 35 天、第 70 天）。他們還驗(yàn)證了該方案可用于使用帕金森病患者的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行體外帕金森病模型的構(gòu)建。

[2] Smits et al. Modeling Parkinson’s disease in midbrain-like organoids. NPJ Parkinsons Dis. 2019 Apr 5;5:5. doi: 10.1038/s41531-019-0078-4.

3.經(jīng)過 30 天培養(yǎng)后（整體染色），優(yōu)化后的中腦類器官中已存在具有功能的多巴胺能神經(jīng)元，并且暴露于 6-羥基多巴胺以模擬帕金森病。

2020 年，施瓦姆邦小組優(yōu)化了他們 2019 年的方案，以減少批次間的差異并避免形成壞死核心。他們通過 TH、GIRK2、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體和多巴胺含量的共染色，證明了所得 3D 微組織中的多巴胺能功能。

[3] Nickels et al. Reproducible generation of human midbrain organoids for in vitro modeling of Parkinson’s disease. Stem Cell Res. 2020 Jul;46:101870. doi: 10.1016/j.scr.2020.101870. Epub 2020 Jun 6.

4.在分化后第 30 天（即在 6-羥基多巴胺損傷發(fā)生及使用間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物治療之前）的中腦組織球體的全切片染色中，TH、GIRK2 和多巴胺的表達(dá)情況如下：

2023 年，為了評(píng)估間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物的治療潛力，來(lái)自葡萄牙米尼奧大學(xué)的一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)采用了斯米茨等人[2]所描述的方案，生成了重現(xiàn)帕金森病樣多巴胺能退化的中腦組織球體。為了在 6-羥基多巴胺暴露之前證明多巴胺能功能，他們對(duì)組織球體切片進(jìn)行了 TH、GIRK2 和多巴胺（IS1005 抗體）的染色。

[4] Mendes-Pinheiro et al. Treating Parkinson’s Disease with Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Secretome: A Translational Investigation Using Human Brain Organoids and Different Routes of In Vivo Administration. Cells. 2023 Nov 2;12(21):2565. doi: 10.3390/cells12212565.

5.一種用于藥物研發(fā)和毒性研究的高通量器官組織平臺(tái)：展示成熟多巴胺能神經(jīng)元（TH、GIRK2）的存在以及微中腦器官組織中多巴胺及神經(jīng)黑素樣顆粒的生成（分化后第 30 天）

2023 年，來(lái)自韓國(guó)的一個(gè)公私合作組織公布了一個(gè)用于生成功能性微中腦器官組織的高通量平臺(tái)。該平臺(tái)旨在進(jìn)行大規(guī)模的藥物研發(fā)和毒性研究，其基于 96 孔和 384 孔板中的單步過程，在 4 周內(nèi)生成具有最小變異性的成熟大腦器官組織。這些結(jié)果器官組織表現(xiàn)出細(xì)胞多樣性，并通過使用 TH 和 GIRK2 以及多巴胺和神經(jīng)黑素樣顆粒的生成來(lái)分析其多巴胺能成分。

[5] Yao et al. Production of Highly Uniform Midbrain Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Int. 2023 Sep 29;2023:3320211. doi: 10.1155/2023/3320211.

如何對(duì)中腦組織球進(jìn)行多巴胺染色？一份實(shí)用指南：

施瓦姆伯恩小組在其第一篇論文中介紹了制備中腦組織球切片的方案，使用了多聚甲醛固定法和低熔點(diǎn)瓊脂糖。與 PFA 固定的組織相兼容的原代多巴胺抗體Primary dopamine antibody  （貨號(hào)：IS1005），按照標(biāo)準(zhǔn)流程成功使用了。

然而，為了減少組織切片中的背景噪音并標(biāo)記完整的標(biāo)本中的多巴胺，我們建議使用 STAINperfect 染色試劑盒（貨號(hào)：SP-A-1000）。該試劑盒與 10 種關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)的抗體兼容，并設(shè)計(jì)用于多重成像，2020 年，由來(lái)自 RIKEN 和加州大學(xué)的 Jens Schwamborn 等人的團(tuán)隊(duì)使用該免疫染色試劑盒，以證明人類中腦組織培養(yǎng)物中存在產(chǎn)生多巴胺、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸和血清素的神經(jīng)元。