大多數(shù)真核mRNAs以典型的帽依賴性方式翻譯。為了啟動(dòng)翻譯，三元復(fù)合物 (eIF2-GTPMet-tRNAi)被裝載到40S核糖體亞單位上，形成43S預(yù)起始復(fù)合物 (PIC)，然后通過由帽結(jié)合蛋白eIF4E、支架蛋白eIF4G和RNA解旋酶eIF4A組成的eIF4F復(fù)合物被招募到mRNA的m7G封端5’端。聚 (A)結(jié)合蛋白 (PABP)促進(jìn)了43S PIC向50帽的募集，該蛋白通過與eIF4F復(fù)合物中的eIF4G相互作用，從mRNA的30聚 (A)尾環(huán)回。在對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)中，通常通過應(yīng)激誘導(dǎo)的eIF2a磷酸化來抑制一般翻譯的啟動(dòng)，這降低了活性三元復(fù)合物的可用性。某些應(yīng)激反應(yīng)性mRNAs，例如酵母中的一般控制非抑制性4 (GCN4)和哺乳動(dòng)物中的激活轉(zhuǎn)錄因子4 (ATF4)，其翻譯通常受到其mRNAs中上游開放閱讀框 (uORFs)的抑制，優(yōu)先翻譯三元復(fù)合物的水平降低。然而，在植物中，盡管在包括模式觸發(fā)免疫 (PTI)在內(nèi)的許多應(yīng)激反應(yīng)中觀察到eIF2a磷酸化，但在GCN2突變體中阻斷這一過程對(duì)生物和非生物應(yīng)激反應(yīng)沒有影響。

2022年7月29日，來自美國杜克大學(xué)的Jinlong Wang及其團(tuán)隊(duì)在Cell (IF: 38.637)雜志上發(fā)表名為PABP/purine-rich motif as an initiation module for cap-independent translation in pattern-triggered immunity的研究。

本文研究了植物在應(yīng)對(duì)病原體感染時(shí)的翻譯調(diào)控機(jī)制，特別是模式觸發(fā)免疫（PTI）信號(hào)通路如何通過非帽依賴性翻譯機(jī)制促進(jìn)應(yīng)激誘導(dǎo)的翻譯組重編程。傳統(tǒng)的翻譯起始通常依賴于mRNA的5'端的帽子結(jié)構(gòu)（m7G-cap），然而在植物中，PTI信號(hào)通路并不依賴于GCN2/eIF2α通路來抑制一般翻譯，而是通過一種非帽依賴性翻譯機(jī)制選擇性翻譯防御相關(guān)mRNA。這種機(jī)制對(duì)于植物在應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫時(shí)快速調(diào)整翻譯組，優(yōu)先合成防御蛋白至關(guān)重要。

研究亮點(diǎn)

1、PTI利用R基序作為IRES效應(yīng)來誘導(dǎo)mRNA的脫帽和防御mRNA的翻譯。

2、PABPs 通過與 eIFiso4G 的關(guān)聯(lián)而不是 eIF4G 激活 R 基序介導(dǎo)的翻譯。

3、MPK3/6在PTI期間使用RACK1作為支架磷酸化eIF4G、PABP和eIF4G。

4、磷酸化抑制eIF4G，同時(shí)激活PABP/eIF4G介導(dǎo)的翻譯。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.037

實(shí)驗(yàn)材料與試劑：

實(shí)驗(yàn)材料：擬南芥（Arabidopsis thaliana）和本氏煙草（Nicotiana benthamiana）植株。

試劑：Synaptic Systems品牌的anti-m7G-cap mouse monoclonal antibody（貨號(hào)：SYS-201-011）用于檢測(cè)mRNA的帽子結(jié)構(gòu)，以及其他用于分子生物學(xué)和生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的常規(guī)試劑。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

mRNA脫帽活性檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在elf18（一種細(xì)菌延伸因子Tu的N端表位）誘導(dǎo)下，植物體內(nèi)mRNA的脫帽活性顯著增加，特別是防御相關(guān)mRNA如TBF1的脫帽程度顯著高于看家基因UBQ10。這表明PTI信號(hào)通路通過增加mRNA脫帽活性來抑制一般翻譯，同時(shí)選擇性促進(jìn)防御mRNA的翻譯。

R-motif作為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）的功能驗(yàn)證：通過突變TBF1 mRNA 5'UTR中的R-motif，發(fā)現(xiàn)這些突變顯著降低了elf18誘導(dǎo)的翻譯活性，表明R-motif在促進(jìn)防御mRNA翻譯中起關(guān)鍵作用。體外翻譯實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了R-motif可以不依賴于帽子結(jié)構(gòu)促進(jìn)mRNA翻譯。

PABP與eIF4G及eIFiso4G的相互作用：分裂熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和Co-IP實(shí)驗(yàn)表明，PABP在elf18誘導(dǎo)下優(yōu)先與eIFiso4G結(jié)合，而與eIF4G的結(jié)合減弱。這表明PABP通過動(dòng)態(tài)調(diào)整與不同eIF的結(jié)合來促進(jìn)防御mRNA的翻譯。

磷酸化分析：使用phos-tag凝膠電泳和LC-MS/MS分析發(fā)現(xiàn)，elf18誘導(dǎo)下PABP、eIF4G和eIFiso4G發(fā)生磷酸化修飾。特別是PABP的S566位點(diǎn)被MPK3/6激酶磷酸化，增強(qiáng)了其與R-motif的結(jié)合能力。磷酸化位點(diǎn)的突變體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了磷酸化在調(diào)控PABP功能中的重要性。

植物抗病性測(cè)試：通過接種病原細(xì)菌測(cè)試發(fā)現(xiàn)，PABP、eIF4G和eIFiso4G的突變體植物在PTI誘導(dǎo)的抗病性方面表現(xiàn)出不同表型。特別是eIFiso4G的突變顯著降低了植物的抗病性，而eIF4G的突變則增強(qiáng)了基礎(chǔ)抗性但不影響PTI誘導(dǎo)的抗病性。

結(jié)論

本研究揭示了植物在應(yīng)對(duì)病原體感染時(shí)通過一種新穎的非帽依賴性翻譯機(jī)制來快速調(diào)整翻譯組，優(yōu)先合成防御蛋白。這一過程涉及mRNA的脫帽、R-motif作為IRES促進(jìn)翻譯、PABP與不同eIF的動(dòng)態(tài)相互作用以及MPK3/6激酶介導(dǎo)的磷酸化修飾。這些發(fā)現(xiàn)不僅增進(jìn)了我們對(duì)植物免疫機(jī)制的理解，也為未來開發(fā)新型植物保護(hù)策略提供了理論依據(jù)。

Synaptic Systems品牌的anti-m7G-cap mouse monoclonal antibody（貨號(hào)：SYS-201-011）在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

mRNA脫帽活性的量化：該抗體能夠特異性識(shí)別mRNA的5'端帽子結(jié)構(gòu)（m7G-cap），通過免疫沉淀（IP）結(jié)合qPCR技術(shù)，可以準(zhǔn)確量化mRNA的脫帽程度。這對(duì)于評(píng)估PTI信號(hào)通路對(duì)mRNA穩(wěn)定性的影響至關(guān)重要。 

驗(yàn)證非帽依賴性翻譯機(jī)制：在研究非帽依賴性翻譯機(jī)制時(shí)，需要排除帽子結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯的影響。該抗體能夠幫助確認(rèn)mRNA是否確實(shí)失去了帽子結(jié)構(gòu)，從而支持R-motif作為IRES功能的結(jié)論。 

提高實(shí)驗(yàn)的可靠性和準(zhǔn)確性：使用高質(zhì)量的特異性抗體可以減少非特異性結(jié)合和背景信號(hào)干擾，提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性。這對(duì)于科學(xué)研究來說至關(guān)重要，尤其是在探索復(fù)雜生物過程的分子機(jī)制時(shí)。 

促進(jìn)相關(guān)領(lǐng)域的研究發(fā)展：該抗體的應(yīng)用不僅限于本研究領(lǐng)域，還可以推廣到其他涉及mRNA穩(wěn)定性和翻譯調(diào)控的研究中。隨著對(duì)mRNA代謝和翻譯調(diào)控機(jī)制理解的深入，該抗體將成為更多相關(guān)研究中的重要工具。 

Synaptic Systems品牌的m3G-cap, m7G-cap antibody - 201 011，在本研究中發(fā)揮了不可或缺的作用，不僅幫助揭示了植物PTI信號(hào)通路中的新型翻譯調(diào)控機(jī)制，還為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了有力支持。