G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）是體內(nèi)最大的信號受體家族，參與幾乎所有的生理過程，并且是重要的藥物靶點。由于GPCR信號傳導(dǎo)的復(fù)雜性，在某些具體通路過程中的調(diào)控機(jī)理仍然存在爭議，為此科學(xué)家們開展了進(jìn)一步的研究。

1.GPCR信號傳導(dǎo)的復(fù)雜性：傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，GPCR的信號傳導(dǎo)主要發(fā)生在質(zhì)膜上。然而，近年來越來越多的證據(jù)表明，許多GPCR在內(nèi)化后仍能繼續(xù)與G蛋白結(jié)合，從而在內(nèi)體上啟動信號傳導(dǎo)。

2.內(nèi)體cAMP信號傳導(dǎo)的爭議：對于許多GPCR，內(nèi)體cAMP信號傳導(dǎo)被認(rèn)為是β-抑制蛋白（β-arrestin）依賴的，因為β-arrestin對于受體的內(nèi)化和內(nèi)體上信號的維持至關(guān)重要。然而，關(guān)于是否存在不依賴于β-arrestin的內(nèi)體cAMP信號傳導(dǎo)存在爭議。

3.VIPR1受體的特殊性：血管活性腸肽受體1（VIPR1）是一種多肽激素受體，已知與β-arrestin結(jié)合，但其內(nèi)化是否依賴β-arrestin尚不清楚。

Emily等人就cAMP信號傳導(dǎo)是否依賴β-抑制蛋白（β-arrestin）發(fā)布表了在線研究《β-Arrestin-independent endosomal cAMP signaling by a polypeptide hormone GPCR》

研究方法

1. 細(xì)胞系和質(zhì)粒構(gòu)建

使用HEK293細(xì)胞系，通過CRISPR技術(shù)構(gòu)建β-arrestin雙敲除（β-arr DKO）細(xì)胞系，以研究β-arrestin在VIPR1內(nèi)化及信號傳導(dǎo)中的作用。

構(gòu)建表達(dá)HaloTag-VIPR1、β-arr2-mApple等融合蛋白的質(zhì)粒，用于細(xì)胞成像和流式細(xì)胞術(shù)分析。

2. cAMP信號檢測

使用Montana Molecular品牌的Green Up cADDis cAMP生物傳感器實時檢測細(xì)胞內(nèi)cAMP水平。該傳感器基于FRET原理，能夠高靈敏度地監(jiān)測cAMP的動態(tài)變化。

在實驗中，通過VIP刺激細(xì)胞，觀察cAMP水平的瞬時變化，并比較野生型與β-arr DKO細(xì)胞系之間的差異。

3. 內(nèi)吞和信號傳導(dǎo)分析

通過流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微鏡觀察VIPR1的內(nèi)化過程；使用NanoBiT蛋白互補(bǔ)系統(tǒng)檢測β-arrestin與VIPR1在內(nèi)體和質(zhì)膜上的結(jié)合情況； 通過阻斷內(nèi)吞途徑或使用GRK抑制劑，進(jìn)一步分析內(nèi)吞和磷酸化對VIPR1信號傳導(dǎo)的影響。

實驗結(jié)果

1. VIPR1的內(nèi)化不依賴β-arrestin

在β-arr DKO細(xì)胞中，VIP仍能誘導(dǎo)VIPR1的內(nèi)化，且內(nèi)化動力學(xué)與野生型細(xì)胞相似；使用流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微鏡觀察到，VIP刺激后VIPR1從質(zhì)膜轉(zhuǎn)移到內(nèi)體。

2. 內(nèi)體cAMP信號傳導(dǎo)不依賴β-arrestin

在β-arr DKO細(xì)胞中，VIP刺激仍能引發(fā)內(nèi)體上的cAMP信號傳導(dǎo)，盡管信號強(qiáng)度較野生型細(xì)胞減弱；NanoBiT實驗表明，VIP刺激后，β-arr2能被招募到內(nèi)體和質(zhì)膜上的VIPR1，但在β-arr DKO細(xì)胞中，內(nèi)體上的信號傳導(dǎo)不受影響。

3. β-arrestin在信號傳導(dǎo)中的新角色

通過比較野生型與β-arr DKO細(xì)胞的cAMP信號曲線，發(fā)現(xiàn)β-arrestin的主要作用是調(diào)節(jié)質(zhì)膜和內(nèi)體信號傳導(dǎo)的時空分布；β-arrestin通過與質(zhì)膜上的VIPR1結(jié)合，加速質(zhì)膜信號傳導(dǎo)的脫敏，從而使內(nèi)體信號傳導(dǎo)以第二個峰值的形式出現(xiàn)。

4. GRK磷酸化對內(nèi)吞和信號傳導(dǎo)的影響

使用GRK抑制劑Cmpd101發(fā)現(xiàn)，VIPR1在質(zhì)膜上與β-arrestin的結(jié)合不依賴于GRK磷酸化，但在內(nèi)體上則需要GRK磷酸化。這表明質(zhì)膜和內(nèi)體上的VIPR1-β-arrestin復(fù)合物具有不同的生化特性。

結(jié)論

1. 內(nèi)體cAMP信號傳導(dǎo)的新模式

VIPR1是首個被證實能在不依賴β-arrestin的情況下在內(nèi)體上產(chǎn)生cAMP信號傳導(dǎo)的GPC；這一發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)的β-arrestin依賴模型，并提出了內(nèi)體信號傳導(dǎo)的新模式。

2. β-arrestin在信號傳導(dǎo)中的新功能

β-arrestin不僅作為內(nèi)吞適配蛋白和信號分子，還通過調(diào)節(jié)質(zhì)膜和內(nèi)體信號傳導(dǎo)的時空分布來精細(xì)調(diào)控GPCR的信號輸出；β-arrestin在質(zhì)膜上形成信號衰減復(fù)合物，加速質(zhì)膜信號傳導(dǎo)的脫敏；而在內(nèi)體上則形成信號中性復(fù)合物，不影響內(nèi)體信號傳導(dǎo)。

3. 對GPCR信號傳導(dǎo)復(fù)雜性的新認(rèn)識

本研究表明，GPCR信號傳導(dǎo)的復(fù)雜性遠(yuǎn)超預(yù)期，不同GPCR在內(nèi)吞和信號傳導(dǎo)方面存在顯著差異； 對VIPR1的研究為理解GPCR信號傳導(dǎo)的多樣性和復(fù)雜性提供了新的視角和方法。

在本研究中，Montana Molecular品牌的Green Up cADDis cAMP生物傳感器（Cat#U0200G）在GPCR信號傳導(dǎo)分析中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，具體體現(xiàn)在以下幾個方面：

1. 高靈敏度實時監(jiān)測

Green Up cADDis cAMP生物傳感器（Cat#U0200G）基于FRET原理，能夠?qū)崟r監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的微小變化。在本研究中，該傳感器成功捕捉到了VIP刺激下cAMP水平的瞬時變化，為分析VIPR1信號傳導(dǎo)提供了關(guān)鍵數(shù)據(jù)。

2. 適用于多種細(xì)胞系和實驗條件

該傳感器適用于多種細(xì)胞系，包括HEK293細(xì)胞等常用模式細(xì)胞。同時，它也適用于不同的實驗條件，如藥物刺激、基因敲除等。

3. 推動GPCR信號傳導(dǎo)研究的發(fā)展

通過實時監(jiān)測cAMP水平，Green Up cADDis cAMP生物傳感器（Cat#U0200G）為GPCR信號傳導(dǎo)的研究提供了強(qiáng)有力的工具。它不僅有助于揭示GPCR信號傳導(dǎo)的分子機(jī)制，還有助于發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點和治療策略。

綜上所述，本研究通過深入分析VIPR1的內(nèi)化和信號傳導(dǎo)機(jī)制，揭示了GPCR信號傳導(dǎo)的復(fù)雜性和多樣性。同時，Green Up cADDis cAMP生物傳感器（Cat#U0200G）在本研究中發(fā)揮了重要作用，為揭示VIPR1信號傳導(dǎo)的動態(tài)過程提供了關(guān)鍵數(shù)據(jù)。這些發(fā)現(xiàn)不僅豐富了我們對GPCR信號傳導(dǎo)機(jī)制的認(rèn)識，還為未來藥物研發(fā)提供了新的思路和方法。