Calcein-AM是一種可對活細胞進行熒光標(biāo)記的細胞染色試劑，Calcein-AM由于在Calcein的基礎(chǔ)上加強了疏水性，因此能夠輕易穿透活細胞膜。當(dāng)其進入到細胞質(zhì)后，酯酶會將其水解為Calcein留在細胞內(nèi)，發(fā)出強綠色熒光。與其它同類試劑(如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate)相比，Calcein-AM是最適合作為熒光探針去染活細胞的，因為它的細胞毒性很低。Calcein的激發(fā)和發(fā)射波長分別為490nm和515nm。   

Calcein,AM僅對活細胞染色。作為核染色染料的PI不能穿過活細胞的細胞膜，它穿過死細胞膜的無序區(qū)域而到達細胞核，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光(激發(fā)：488,545nm，發(fā)射：617nm)，因此PI僅對死細胞染色。  

由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。用545nm激發(fā)，僅可觀察到死細胞。根據(jù)以上特點，Calcein AM和PI經(jīng)常被結(jié)合用來作為活細胞和死細胞的雙重染色。   

今天就給大家?guī)硪豢罨贑alcein AM和PI的活死細胞雙染試劑盒(B-CHK103)，本染色方法適用于熒光顯微鏡、熒光酶標(biāo)儀等微孔板熒光掃描設(shè)備、流式細胞儀或其他的熒光設(shè)備。本染色方法適用于大多數(shù)真核細胞，包括貼壁細胞和某些組織樣本，但不包括細菌和酵母樣本。   

需要注意的是Calcein AM/PI雙染有效染色的前提是相應(yīng)的細胞模型的活力變化是指酶活性變化和質(zhì)膜完整性變化這些物理和生化特性，不影響這些細胞特性的細胞毒性事件可能不能使用此方法進行準確評估。 

不同檢測平臺的建議步驟：

熒光顯微鏡檢測：

• 準備樣本細胞。

• 用PBS洗滌細胞2～3次。

• 用100～150μL染色工作液A至蓋玻片將細胞樣品覆蓋(或重懸)。

• 在室溫或37℃避光孵育20～45分鐘。

• 用PBS洗滌細胞。

• 用100～150μL染色工作液B至蓋玻片將細胞覆蓋(或重懸)。

• 在室溫或37℃避光孵育10～45分鐘。

• 用PBS洗滌細胞。

• 用熒光顯微鏡檢測結(jié)果。最大激發(fā)為490nm，最大發(fā)射波長分別為515nm和617nm。

流式細胞儀檢測：

• 收集細胞：可以用胰酶-EDTA等消化細胞，制備成細胞懸液。

• 用PBS洗滌細胞兩次。

• 制備1mL細胞懸浮液，濃度為0.1至5×10⁶細胞/mL。細胞可以在無血清培養(yǎng)基或其他緩沖液中重懸。

• 在細胞中加入適量Calcein-AM溶液和適量PI母液，混勻。

• 在室溫或37℃避光孵育15～30分鐘。

• 盡快用流式細胞儀檢測結(jié)果。

熒光酶標(biāo)儀檢測：

• 在微孔板中準備細胞樣本孔以及對照孔。

• 用PBS洗滌細胞2～3次。

• 加入200μL染色工作液。

• 在室溫或37℃避光孵育15～45分鐘.

• 用PBS洗滌細胞。

• 加入適量PBS。

• 用熒光酶標(biāo)儀/熒光光度計檢測結(jié)果。最大激發(fā)波為490nm，最大發(fā)射波長為525nm和617nm。

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