在開發(fā)了Lipofection（基于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染方法）和Magnetofection（基于磁性納米顆粒的轉(zhuǎn)染方法）之后，OZ Biosciences設(shè)計(jì)和合成一種新型專利陽(yáng)離子羥基化兩親性多嵌段聚合物（Cationic Hydroxylated Amphiphilic Multi-block Polymer，CHAMP），該聚合物具有生物相容性，可切割性，pH響應(yīng)性和雙功能性。  

OZ Biosciences基于CHAMP技術(shù)創(chuàng)建了一種全新的轉(zhuǎn)染試劑，這種新型的雙功能共聚物是生物相容的，可電離的和pH敏感的。它由三個(gè)部分組成，其組合并引入三個(gè)協(xié)同概念：“穿過膜屏障”的概念是由于其電荷、pH敏感性和疏水性；“隱形轉(zhuǎn)染”的想法是由于DNA被保護(hù)，掩蓋和支持，一直到核攝取；生物相容性的概念是由于生物可降解和可切割的部分。  

基本原理：

這種新型CHAMP技術(shù)的特殊性來自于雙功能陽(yáng)離子生物聚合物由三個(gè)部分組成，每個(gè)部分具有不同的特性和功能。 

（1）聚合物附近的第一部分將DNA結(jié)合和縮合到前所未有的水平，并有助于細(xì)胞質(zhì)遞送。 

（2）第二部分是pH響應(yīng)性和可切割的接頭，通過促進(jìn)內(nèi)體膜的不穩(wěn)定來改善細(xì)胞傳遞。 

（3）具有確定和優(yōu)化的分子量的第三部分用作DNA屏蔽和核攝取促進(jìn)劑。 每個(gè)部分的分子量和長(zhǎng)度（對(duì)于每種類型的聚合物是唯一的）是與整體轉(zhuǎn)染效率相關(guān)的重要參數(shù)。  

工作原理：

1. 保護(hù)和血清穩(wěn)定性

OZ Biosciences的新型CHAMP聚合物Helix-IN的設(shè)計(jì)使帶正電荷的復(fù)合物在溶液中保持穩(wěn)定，不會(huì)隨時(shí)間推移而聚集。 

對(duì)CHAMP聚合物的結(jié)構(gòu)、多胺組成和接枝密度進(jìn)行微調(diào)和優(yōu)化，以將聚合物放置在溶解度不受時(shí)間影響的精確界面處。此外，親水基團(tuán)被巧妙地布置在聚合物中，以降低與帶負(fù)電荷的血清蛋白（白蛋白......）的相互作用，從而更有效地定義基因載體。 

聚合物保持完整，DNA被保護(hù)免受降解... 

這種帶正電荷的雙功能聚合物具有增強(qiáng)的DNA結(jié)合性能，可以在一定程度上保護(hù)DNA；正的DNA/聚合物電荷比使DNA與聚合物結(jié)合，在保護(hù)核酸不被血清酶降解方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。OZ Biosciences設(shè)計(jì)了這種聚合物，即使在50%胎牛血清中37°C孵育24小時(shí)也不會(huì)觀察到DNA降解。  

2. 細(xì)胞攝取

陽(yáng)離子復(fù)合物主要通過靜電相互作用與細(xì)胞膜結(jié)合，并且大多數(shù)復(fù)合物通過內(nèi)吞作用途徑（巨胞飲作用、吞噬作用、內(nèi)吞作用）被細(xì)胞攝取。有文獻(xiàn)記載內(nèi)吞作用的途徑之一是由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的。 

一旦被內(nèi)吞，復(fù)合物被內(nèi)吞在早期的核內(nèi)體中，pH從7.4（細(xì)胞表面）下降至6.0（核內(nèi)體腔內(nèi)）。隨著核內(nèi)體進(jìn)入晚期，pH值將降至5。  

3. 內(nèi)體逃逸和DNA釋放

聚合物通過與“質(zhì)子海綿”效應(yīng)相關(guān)的陽(yáng)離子聚合物緩沖能力逃避核內(nèi)體并將其攜帶物釋放到核中。 

在酸性介質(zhì)中充當(dāng)弱堿的可質(zhì)子化胺使核內(nèi)體內(nèi)的pH不穩(wěn)定：一旦進(jìn)入核內(nèi)體，特異性ATP酶會(huì)產(chǎn)生大量質(zhì)子流入，這些質(zhì)子被聚合物緩沖。大量和持續(xù)的質(zhì)子流動(dòng)伴隨著氯離子的被動(dòng)進(jìn)入，導(dǎo)致水的積累。因此，囊泡膨脹直到內(nèi)體破裂，其內(nèi)容物被遞送到細(xì)胞質(zhì)中。 

第一聚合物嵌段起此作用。此外，pH響應(yīng)性和可切割的疏水部分增加了補(bǔ)充功能。實(shí)際上，隱藏在生理pH值下的連接體在酸性pH值下會(huì)暴露出來，導(dǎo)致其裂解和疏水區(qū)暴露，從而促進(jìn)內(nèi)體膜融合/不穩(wěn)定。 

在這個(gè)階段，幾個(gè)重要的缺陷可能會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率：（1）DNA從核內(nèi)體逃逸的能力是轉(zhuǎn)染的主要限制之一；（2）通常認(rèn)為，DNA必須迅速導(dǎo)入細(xì)胞核以避免細(xì)胞質(zhì)降解；（3）核內(nèi)體(也在細(xì)胞表面)中存在細(xì)胞傳感器，可以識(shí)別外源核酸并誘導(dǎo)抑制轉(zhuǎn)染的保護(hù)性反應(yīng)。  

4. 運(yùn)輸和核內(nèi)部化

一旦從核內(nèi)體釋放出來，多聚體必須經(jīng)由微管或通過核輸入機(jī)制迀移到細(xì)胞核。通常，大分子DNA（>3000bp）和聚合物幾乎保持不動(dòng)，因?yàn)橄蚣?xì)胞質(zhì)的擴(kuò)散依賴于尺寸大小，并且許多細(xì)胞質(zhì)核酸酶會(huì)降解核酸。由于仍與雙功能聚合物的第三部分結(jié)合，較小的帶正電荷的聚合物可以與陰離子微管或馬達(dá)蛋白相互作用，或以隱形模式擴(kuò)散，直到它們發(fā)生核攝取。在所有這些過程中，DNA被掩蓋并被保護(hù)不被降解。 

永生化細(xì)胞進(jìn)入核的最明顯方式是在有絲分裂期間，發(fā)生細(xì)胞物質(zhì)的再分布并且核膜被破壞，然而，并非所有細(xì)胞都遵循增殖模式。到目前為止，對(duì)復(fù)合物載體的核導(dǎo)入知之甚少。 一旦DNA到達(dá)細(xì)胞核，它就會(huì)從帶正電荷的聚合物的第二部分釋放出來，分子量和接枝設(shè)計(jì)的目的是改善轉(zhuǎn)染。

圖示：細(xì)胞內(nèi)聚合物的運(yùn)輸。（1）多聚復(fù)合物表面過量的多聚陽(yáng)離子允許附著于細(xì)胞表面，（2）并被靶細(xì)胞攝取或內(nèi)化，通常通過內(nèi)吞作用。（3）一旦進(jìn)入核內(nèi)體囊泡，質(zhì)子-海綿聚合物的較高程度的質(zhì)子化引起離子的流入，并且pH響應(yīng)性接頭被切割，釋放第一聚合物部分（藍(lán)色）。（4）滲透壓力的增加導(dǎo)致囊泡膨脹和破裂，這是由于連接體疏水區(qū)域的暴露。 第三個(gè)部分（紅色）保持與核酸結(jié)合，從而降低細(xì)胞對(duì)DNA的感應(yīng)，并通過直接輸入細(xì)胞核（5a）或通過微管運(yùn)輸（5 b）來輔助其核遞送。（6）一旦進(jìn)入細(xì)胞核，DNA就會(huì)被表達(dá)。   

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應(yīng)用：

主要用途是用于體外和體內(nèi)應(yīng)用的DNA轉(zhuǎn)染。CHAMP技術(shù)增加了轉(zhuǎn)染量：更多的DNA進(jìn)入細(xì)胞，DNA以隱形模式尋址到細(xì)胞核，而不會(huì)引起細(xì)胞的警覺和應(yīng)激......該試劑是優(yōu)先粘附的永生化細(xì)胞系的理想選擇，如HEK-293，NIH-3 T3，CHO，COS，HeLa，MCF 7，MEF，RPE-1，C2C12....

它非常適合多個(gè)DNA的共轉(zhuǎn)染。在體內(nèi)，DNA被濃縮并保護(hù)成小的多聚物，限制免疫應(yīng)答，并能夠通過循環(huán)系統(tǒng)導(dǎo)航，直到它們被遞送。  

如何使用HELIX-IN聚合物轉(zhuǎn)染試劑？

該protocol是一個(gè)非常簡(jiǎn)單明了的程序，大體流程如下： 

根據(jù)細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染試劑以1：1至3：1的比例（每?g DNA 1?L至每?g DNA 3?L）直接與DNA混合。孵育30分鐘后，Polyplexes和boost被添加到細(xì)胞上。   

這30分鐘的孵育時(shí)間是該方案的基石，允許完全壓縮和保護(hù)DNA。

在納米顆粒/DNA復(fù)合物自組裝過程中，至少等待30分鐘才能使共聚物和DNA形成穩(wěn)定的超分子納米顆粒。由于共聚物的多部分性質(zhì)，形成和穩(wěn)定復(fù)合物的時(shí)間略長(zhǎng)于“簡(jiǎn)單”聚合物，“簡(jiǎn)單”聚合物形成更快（10-20分鐘）。 

產(chǎn)品引用文章鑒賞：

1. Solinger, J.A., Rashid, HO. & Spang, A. FERARI and cargo adaptors coordinate cargo flow through sorting endosomes. Nature Communications13, 4620 (2022).（使用OZ Biosciences的HELIX-IN聚合物轉(zhuǎn)染試劑）

2. Cadena del Castillo, C.E., Hannich, J.T., Kaech, A. et al. Patched regulates lipid homeostasis by controlling cellular cholesterol levels. Nature Communications12, 4898 (2021). （使用OZ Biosciences的HELIX-IN聚合物轉(zhuǎn)染試劑）

3. Liu, X., Salokas, K., Weldatsadik, R.G. et al. Combined proximity labeling and affinity purification?mass spectrometry workflow for mapping and visualizing protein interaction networks. Nature Protocols15, 3182–3211 (2020). （使用OZ Biosciences的HELIX-IN聚合物轉(zhuǎn)染試劑）

4. Liu, X., Salokas, K., Tamene, F. et al. An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations. Nature Communications9, 1188 (2018).（使用OZ Biosciences的HELIX-IN聚合物轉(zhuǎn)染試劑）

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