您可能聽說過這樣的說法：“所有美好的事物終將結束”——尤其是在珍貴的原代細胞培養(yǎng)物在幾次傳代后達到衰老狀態(tài)時。然而，得益于永生化細胞系的開發(fā)，這種情況已不再如此！在本文中，我們將介紹：

一．什么是永生化細胞？

您可能習慣于使用直接從活體組織中提取的細胞，稱為原代細胞。原代細胞的難點在于，每次細胞分裂后，它們的端粒都會縮短，導致細胞進入衰老狀態(tài)并停止分裂，僅經過幾個細胞周期。這意味著如果您正在進行長期項目，您將經常需要不斷收獲和重新建立新的原代細胞批次。此外，由于不同的收獲條件，每個細胞批次都是不同的，這使得可重復性成為一個問題！ 

永生化細胞（也稱為連續(xù)細胞或細胞系）是端粒和/或腫瘤抑制基因已經被改變的原代細胞。腫瘤抑制基因（例如p53和Rb）對于在DNA損傷的可能性更高時（即在多個細胞周期后，更多關于細胞周期的信息請訪問我們的知識庫）向細胞發(fā)出停止分裂的信號非常重要。在永生化細胞的情況下，這些基因已經被抑制或其功能被抑制，使細胞能夠無限期地繼續(xù)分裂。

圖1 -端粒是DNA的重復區(qū)域，形成染色體末端的保護“帽”，保護染色體免受退化。經過每一輪細胞周期，這些端粒會變短，Z終導致細胞進入衰老階段，細胞停止分裂。  

理想的永生化細胞具有與其親本組織相似的基因型和表型。一些實驗室使用相同的永生化細胞數十年，因此，它們的細胞系已經被很好地表征，并為其長期項目提供了一致的基線。Z古老和Z常用的人類細胞系是HeLa細胞系，該細胞系是在20世紀50年代從宮頸癌細胞中建立的！但是，正如您將在本文的質量控制部分看到的，檢查細胞系的身份以確保您的細胞系是您認為的那樣是非常重要的。

二．細胞永生化策略

那么，您如何工程化一個永生化細胞系呢？有兩種主要方法：

方法A：端粒酶逆轉錄酶蛋白（TERT）表達

TERT蛋白是端粒酶的催化亞基，在大多數體細胞中通常不活躍。在這種方法中，您可以將編碼人類端粒酶逆轉錄酶（hTERT）蛋白的cDNA插入到您感興趣的原代細胞中。當hTERT被外源性表達時，細胞能夠維持足夠的端粒長度以避免衰老。這是最近開發(fā)用于細胞永生化的方法。

方法B：病毒致癌基因

病毒致癌基因，如SV40病毒的大T抗原或HPV的E6/E7致癌基因，可以通過抑制腫瘤抑制基因（例如p53和Rb）來實現永生化。這種方法比方法A更快地生效，但可能會改變一些細胞的特性。

在許多情況下，單獨使用方法A和B可能不足以成功實現永生化。最近的研究發(fā)現，共同表達hTERT和病毒致癌基因具有更高的成功率，并產生更真實和正常的細胞模型，具有明確定義的遺傳背景。

圖2展示了正常細胞的典型壽命（綠色箭頭）。每次分裂，端粒縮短，直到最終達到所謂的衰老狀態(tài)，此時細胞停止復制并死亡。通過過度表達或抑制特定基因（例如破壞p53和RB途徑），我們可以逆轉或抑制端粒縮短，使細胞繼續(xù)分裂而不達到衰老。

表1：本表展示了常見的永生化方法。每種機制都涉及破壞圖2中顯示的復制過程中的關鍵基因。右列描述了abm的永生化試劑系列中可用的形式。您可以在我們的知識庫上閱讀有關不同病毒的更多信息。 

三．永生化工作流程概述

圖3：基本的細胞系永生化工作流程。

細胞系質量控制考慮

太好了！在這個階段，您已經生成了一個永生化細胞系。但是，在您開始在項目中使用您的細胞系之前，有一些重要的質量控制檢查您可以進行，以確保您的細胞系處于完美狀態(tài)。

A.您的細胞系表征

每次永生化后，您應該始終檢查您的細胞是否具有適當的標記，以及細胞的功能，以確保它代表您所使用的原代細胞。當您研究細胞途徑時，這一步尤為重要，因為您不希望永生化步驟改變了特定途徑、功能或細胞的表型。 例如，如果您計劃使用您的細胞進行細胞毒性測定，那么使用您的永生化細胞與原代細胞一起進行細胞毒性測定是個好主意，以確保您新永生化的細胞對刺激的反應與它們的原始細胞相似。

B.傳代和轉基因表達測試

將您的細胞傳代至少30次，以證明轉基因已穩(wěn)定表達，并觀察它們的生長速度已提高，密度能力已增加。

C.STR分析

正如本文開頭提到的，驗證您的細胞系身份至關重要，因為可能會發(fā)生交叉污染或種群混合的問題。例如，根據《科學》雜志上發(fā)表的一篇論文，廣泛用于實驗室的著名HeLa細胞被發(fā)現污染了許多細胞系，包括Hep-2和INT407細胞系。 

識別細胞系的黃金標準是短串聯(lián)重復（STR）分析。STR分析是一種方法，其中在特定位點的短串聯(lián)DNA重復與標準參考配置文件進行比較。細胞系的STR分析可以用來確認其身份，定期進行STR分析是個好主意，以確保您的細胞系沒有隨著時間的推移受到污染。 

為了應對細胞系誤識別事件，資助機構如NIH現在要求在資助申請中使用的細胞系進行STR分析，許多期刊也開始鼓勵這個關鍵的質量控制檢查。

D.支原體和病原體檢測

最后，始終測試微生物污染物，如真菌、細菌和支原體是個好主意。特別是支原體，是細胞培養(yǎng)實驗室中Z常見的污染物之一。通常很難通過顯微鏡下的視覺檢查來檢測支原體。然而，這種細菌可以影響細胞的增殖，改變其基因表達譜，并可能扭曲您的實驗結果。有許多試劑盒可用，例如abm的PCR支原體檢測和清除試劑盒，可以輕松檢測并清除50多種類型的支原體。   

我們希望本文能幫助您獲得開始您的第一個細胞永生化項目所需的信心！如果永生化過程聽起來太麻煩了，不用擔心——有許多細胞系庫可用，包括abm的500+永生化細胞系和800+獨特的細胞系，用于藥物發(fā)現，全球可用。您可以在這里查看我們的目錄或索取免費的實體副本。沒有看到您正在尋找的特定細胞系，請查看下方表格（部分產品），或者請隨時與abm中國區(qū)代理，艾美捷科技聯(lián)系！400-6800-868，m.zihai029.com

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