哺乳動物可溶性環(huán)氧化物水解酶（SEH）是a/β-水解酶折疊家族的成員，催化外源和內(nèi)源環(huán)氧化物水解為鄰位二醇。SEH是由兩個結(jié)構(gòu)域組成的同二聚體。C末端結(jié)構(gòu)域負責環(huán)氧化物水解酶活性，而N末端結(jié)構(gòu)域具有磷酸酶活性的催化中心。sEH的內(nèi)源性底物包括環(huán)氧二十碳三烯酸（EETs），它具有血管舒張和抗炎活性。抑制sEHin動物模型已被證明能有效治療高血壓和血管炎癥以及相關(guān)綜合征。?這些研究證明了靶向sEH開發(fā)小分子抑制劑作為治療劑的價值。

Cayman的基于熒光的sEH抑制劑篩選試劑盒為篩選人環(huán)氧化物水解酶抑制劑提供了一種簡便的方法。該方法利用（3-苯基-氧雜環(huán)烷基）-乙酸氰基-（6-甲氧基-萘-2-yl）-甲酯（PHOME）作為底物。當PHOME的環(huán)氧基被環(huán)氧化物水解酶水解時，發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化，導致在堿性條件下釋放氰醇。氰醇迅速分解為氰離子和高度熒光的6-甲氧基-2-萘甲醛，可以在330 nm的激發(fā)波長和465 nm的發(fā)射波長下進行分析。

特點：

sEH抑制劑篩選

檢測45個樣本，一式兩份

基于平板的熒光測量（例如330 nm，em 465 nm）

需要但未提供的材料：

1.一種熒光計，能夠分別使用330和465nm的激發(fā)和發(fā)射波長測量熒光

2.可調(diào)式移液器和重復移液器

3.超純水來源（Milli-Qor HPLC級水）

實驗前準備：

注意：用于準備所有試劑和緩沖液的水必須經(jīng)過去離子處理。玻璃蒸餾水、HPLC級水和無菌水（用于注射）適用于本試劑盒。可以從Cayman購買UltraPure水（項目編號400000）。

試劑準備：

1. SEH測定緩沖液（10X）

將3毫升的SEH測定緩沖液（10X）濃縮液（項目編號600036）用27毫升的HPLC級水稀釋。最終的測定緩沖液，25mM雙Tris，pH 7.0，應用于測定和稀釋環(huán)氧水解酶。如果儲存在-20℃，這種稀釋后的測定緩沖液至少穩(wěn)定六個月。

2. sEH（人重組）

每個小瓶（項目編號600037）含有12μl的人重組sEH。在冰上解凍酶。在測定前，直接向一個酶小瓶中加入588μl的冷測定緩沖液。這足夠用于整個96孔板的酶。如果不使用整個板，根據(jù)需要相應調(diào)整稀釋酶的量，使用前將酶用冷測定緩沖液稀釋1:50。稀釋后的酶在冰上穩(wěn)定四小時。準備剩余未稀釋酶的小份，并儲存在-80℃。

3. sEH底物

小瓶（項目編號600038）含有600μl的10μM PHOME溶液，溶于二甲基亞砜（DMSO）。底物已準備好，可以直接使用。底物的最終濃度為0.25μM，低于估計的Km值1.5μM。對于競爭性抑制劑，IC50取決于底物濃度，并應在發(fā)表實驗結(jié)果時報告。

移液提示：

- 使用不同的槍頭來移液緩沖液、底物、抑制劑和蛋白質(zhì)。

- 在移液每種試劑之前，先將移液器槍頭在該試劑中平衡（即，緩慢充滿槍頭并輕輕排出內(nèi)容物，重復幾次）。

- 不要將移液器槍頭暴露在已經(jīng)在孔中的試劑中。

一般信息：

- 所有孔的測定最終體積為200μl。

- 沒有必要一次使用板上的所有孔。

- 測定溫度為25℃。在測定前將測定緩沖液和底物預熱至室溫。

- 可能需要在幾個濃度下測定抑制劑以確定有效濃度。

- 如果使用DMSO作為溶劑，建議所有稀釋都在玻璃瓶中進行。使用塑料瓶可能會導致生物活性污染物的溶出，這可能會干擾測定。

- 我們建議將樣品進行三次重復測定，但是否這樣做取決于用戶的決定。

- 可以在三次重復中測定三十個抑制劑樣品，或者在兩次重復中測定四十五個樣品。

分析計算：

1. 確定背景孔的平均熒光（AF）、100%初始活性孔和每個抑制劑的平均熒光。

2. 從100%初始活性和抑制劑AF中減去背景AF。

3. 使用以下公式計算剩余的百分比活性：

4. 如果測試了初始抑制的多種濃度，請將百分比活性作為抑制劑濃度的函數(shù)繪制成圖，以確定IC50值（抑制50%的濃度）。

精度：

批內(nèi)變異系數(shù)=7.0%（n=12）。批間變異系數(shù)=7%（n=5）。

圖.AUDA對人重組sEH的抑制作用（IC₅₀=1nM）

文獻參考：

1.Chiamvimonvat,N.,Ho,C.-M.,Tsai,H.-J.,et al.The soluble epoxide hydrolaseas a pharmaceutical target for hypertension.J.Cardiovasc.Pharmacol.50(3),225-237(2007).

2.Yu,Z.,Xu,F.,Huse,LM.,et al.Soluble epoxide hydrolase regulates hydrolysisof vasoactive epoxyeicosatrienoic acids.Circ.Res.87,992-998(2000).

3.Imig,J.D.,Zhao,X.,Zaharis,C.Z.,et al.An orally active epoxide hydrolaseinhibitor lowers blood pressure and provides renal protection insalt-sensitive hypertension.Hypertension 46(2),975-981(2005).

4.Wolf,N.M.,Morisseau,C.,Jones,P.D.,et al.Development of ahigh-throughput screen for soluble epoxide hydrolase inhibition.Anal.Biochem.355,71-80(2006).