科學(xué)家們已經(jīng)研發(fā)了多種超分辨率技術(shù)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了衍射極限，能夠觀察到分子尺度的細(xì)節(jié)。SRM技術(shù)可以將細(xì)胞結(jié)構(gòu)解析為亞細(xì)胞水平，從而獲取有關(guān)細(xì)胞組分的3D結(jié)構(gòu)的信息，并可以觀察到單分子共定位。一起來(lái)了解一下其中一種SRM技術(shù)【受激發(fā)射耗竭（STED）顯微鏡】的原理：

STED對(duì)于有經(jīng)驗(yàn)的熒光顯微鏡使用者來(lái)說(shuō)相對(duì)簡(jiǎn)單，該方法和普通共聚焦顯微鏡（Confocal）的原理相同。普通Confocal使用單光源，而STED使用雙光源。其中一個(gè)光源發(fā)射能激發(fā)熒光團(tuán)——熒光標(biāo)簽（研究者們以此來(lái)定位和觀察蛋白）的光，另一個(gè)光源發(fā)出不同波長(zhǎng)的光，用于抑制熒光。這束光是環(huán)形的，并且與第一束光有所重疊，因此只有環(huán)形中間區(qū)域的分子會(huì)繼續(xù)發(fā)出熒光。

獲得STED超分辨率圖片并沒(méi)有那么復(fù)雜，用戶(hù)需要仔細(xì)調(diào)整參數(shù)，才能得到漂亮的結(jié)果，否則所得圖片和普通confocal沒(méi)有差別。

STED的原理：

顯微鏡透鏡對(duì)光的衍射會(huì)導(dǎo)致來(lái)自單個(gè)點(diǎn)的光出現(xiàn)在較大的區(qū)域，這稱(chēng)為點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）（見(jiàn)圖1），由于PSF的存在，使得常規(guī)顯微鏡無(wú)法達(dá)到超分辨。

圖1：在普通光學(xué)顯微鏡中，成像是通過(guò)將來(lái)自點(diǎn)光源的光線會(huì)聚到像平面上的單個(gè)點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。超出光衍射的限制，防止了射線的精確會(huì)聚，從而導(dǎo)致物體的圖像模糊。顯微鏡的分辨率取決于點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）的大小，或?qū)ο笤谀硞€(gè)點(diǎn)的三維強(qiáng)度分布。在STED中，應(yīng)用環(huán)形炸彈耗盡型激光器，其零點(diǎn)與激發(fā)激光焦點(diǎn)的最大值重疊。STED激光器引起熒光的“飽和耗盡”，從而“抑制了來(lái)自零點(diǎn)附近區(qū)域的熒光，導(dǎo)致有效PSF的尺寸減小”。

而受激發(fā)射耗竭（STED）顯微鏡通過(guò)限制樣品的熒光區(qū)域（PSF）產(chǎn)生超分辨率圖像。STED顯微鏡使用兩個(gè)重疊的激光，第一個(gè)按照常規(guī)顯微鏡激發(fā)熒光團(tuán)（圖2A）。第二個(gè)激光器稱(chēng)為耗盡激光器（STED激光器），它激發(fā)“甜甜圈”形狀的激光，其中心的零強(qiáng)度點(diǎn)非常小（?30 nm）（未激發(fā)）。除了在甜甜圈的中心處之外，第二激光起到了“關(guān)閉”第一激光所產(chǎn)生的外圈熒光，從而將樣本激發(fā)的熒光分子范圍縮小到中心圓點(diǎn)處，這有效地降低了PSF，以產(chǎn)生非常小的單分子熒光聚焦區(qū)域，從而獲得高分辨率圖像（圖2D）。

圖2：1.單個(gè)小于250 nm的蛋白質(zhì)無(wú)法通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)共聚焦成像解析，從而導(dǎo)致圖像模糊；2.STED耗盡激光器產(chǎn)生了淬滅外圍熒光的“甜甜圈”；3.飽和耗盡在功能上降低了激勵(lì)PSF；4.隨之可以解析單個(gè)蛋白質(zhì)

適用于STED的熒光團(tuán)偶聯(lián)抗體：

為了獲得超分辨率，染料必須具有STED激光波長(zhǎng)的高發(fā)射截面，并有效地實(shí)現(xiàn)高飽和度。這種強(qiáng)烈的照明確保了所有被STED激光“關(guān)閉”的分子都受受激發(fā)射的支配。合適的染料應(yīng)具有低的光漂白性，具有高的量子產(chǎn)率和對(duì)比度，并在目標(biāo)附近具有足夠的標(biāo)記密度。

艾美捷Jackson ImmunoResearch提供熒光染料標(biāo)記的二抗，下列染料標(biāo)記的二抗已被驗(yàn)證在STED中成功使用：

染料 貨號(hào)

AlexaFluor?488——115-545-003

FITC——715-095-150

AlexaFluor?594/647 ——715-585-151

每種SRM技術(shù)都有各自的探針選擇要求，Jackson ImmunoResearch提供多種已知在SRM應(yīng)用中表現(xiàn)良好的熒光標(biāo)記二抗。應(yīng)該注意的是，SRM領(lǐng)域變化迅速，因此，建議從專(zhuān)業(yè)技術(shù)文獻(xiàn)中尋求信息，以幫助選擇合適的熒光團(tuán)。