Hsp90（熱休克蛋白90）是一種在真核細(xì)胞中廣泛存在的分子伴侶，與20多種cochaperones（輔助蛋白）合作，負(fù)責(zé)數(shù)百種客戶蛋白的成熟過(guò)程。盡管Hsp90已經(jīng)被研究了數(shù)十年，但其功能復(fù)合體的組成成分以及ATP水解能量如何被利用以實(shí)現(xiàn)循環(huán)操作仍然不甚清楚。本研究通過(guò)單分子FRET技術(shù)，展示了輔助蛋白如何引入Hsp90在與激酶Ste11相互作用過(guò)程中的構(gòu)象變化的方向性。研究發(fā)現(xiàn)，三個(gè)輔助蛋白是將ATP水解與構(gòu)象變化耦合所必需的，這對(duì)于功能性循環(huán)操作至關(guān)重要。

研究者們使用了單分子F?rster共振能量轉(zhuǎn)移（smFRET）技術(shù)來(lái)觀察Hsp90與客戶激酶Ste11相互作用過(guò)程中的構(gòu)象變化。通過(guò)測(cè)量FRET效率，可以區(qū)分Hsp90的開(kāi)放和閉合構(gòu)象。此外，研究者們還開(kāi)發(fā)了一種測(cè)試程序，使用外部激光觸發(fā)來(lái)在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中創(chuàng)建人工方向性，以驗(yàn)證單分子實(shí)驗(yàn)中方向性的檢測(cè)和分析能力。

實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)中，研究者們首先驗(yàn)證了他們的數(shù)據(jù)分析方法SMACKS和Hidden-Markury在模擬數(shù)據(jù)上的表現(xiàn)，這些模擬數(shù)據(jù)包含了不同方向性（ΔG值）的系統(tǒng)。接著，他們將這些方法應(yīng)用于Hsp90復(fù)合體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析了在不同條件下Hsp90的動(dòng)力學(xué)行為，包括在有無(wú)輔助蛋白和客戶激酶存在時(shí)的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，只有當(dāng)所有三個(gè)輔助蛋白（Aha1、Sba1和Cdc37）以及客戶激酶Ste11存在時(shí)，Hsp90的動(dòng)力學(xué)行為才表現(xiàn)出明顯的方向性。

結(jié)論

得出結(jié)論，Hsp90的功能循環(huán)操作需要三個(gè)輔助蛋白的參與，以將ATP水解的能量傳遞給Hsp90的構(gòu)象變化。這種方向性的變化是激酶成熟過(guò)程中能量效率最高的途徑。此外，研究還發(fā)現(xiàn)Hsp90的ATPase活性與方向性只有微弱的聯(lián)系，表明Hsp90的構(gòu)象狀態(tài)與ATP水解并不緊密相關(guān)。

RAPP Polymere的methoxy-polyethylene glycol–silane(Cat# 125000-71)的作用和價(jià)值:

在本研究中，Rapp Polymere品牌的methoxy-polyethylene glycol–silane（MPEG-Si）起到了重要的作用。MPEG-Si是一種用于表面改性的化合物，它在實(shí)驗(yàn)中被用來(lái)防止非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合到測(cè)量室的表面上。這對(duì)于單分子測(cè)量至關(guān)重要，因?yàn)榉翘禺愋越Y(jié)合可能會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。

MPEG-Si的價(jià)值在于其能夠創(chuàng)建一個(gè)抗非特異性吸附的表面，這對(duì)于提高實(shí)驗(yàn)的特異性和可重復(fù)性至關(guān)重要。在實(shí)驗(yàn)中，MPEG-Si與silane-PEG-Biotin混合使用，以增強(qiáng)對(duì)測(cè)量室表面的被動(dòng)化處理。這種處理不僅減少了背景信號(hào)，還確保了只有生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)能夠通過(guò)biotin-Neutravidin結(jié)合到室表面，從而允許對(duì)單個(gè)蛋白質(zhì)分子的行為進(jìn)行精確測(cè)量。

通過(guò)使用Rapp Polymere品牌的MPEG-Si，研究者們能夠確保實(shí)驗(yàn)條件的穩(wěn)定性和可靠性，這對(duì)于揭示Hsp90與輔助蛋白相互作用的復(fù)雜動(dòng)態(tài)至關(guān)重要。MPEG-Si的使用提高了實(shí)驗(yàn)的信噪比，使得研究者能夠更清晰地觀察到Hsp90的構(gòu)象變化和方向性行為，從而為理解Hsp90的功能機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

總的來(lái)說(shuō)，Rapp Polymere品牌的MPEG-Si在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，它不僅提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，還為深入理解Hsp90的功能和調(diào)控機(jī)制提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。這種化合物的應(yīng)用展示了在生物物理和分子生物學(xué)研究中，表面化學(xué)的重要性以及如何通過(guò)精確控制實(shí)驗(yàn)條件來(lái)獲得高質(zhì)量的科學(xué)數(shù)據(jù)。