VHH 抗體（納米抗體）

重鏈抗體

VHH 抗體（納米抗體）正迅速被應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，包括醫(yī)學(xué)診斷、治療、生物傳感器、結(jié)晶伙伴和小分子檢測(cè)等。VHH抗體來(lái)源于駱駝重鏈免疫球蛋白（IgG亞類2和3）的VHH結(jié)構(gòu)域。通過篩選駱駝科宿主動(dòng)物（通常是羊駝或駱駝）的 VHH 文庫(kù)，獲得具有目標(biāo)特異性的 VHH 序列，然后在選定的表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)重組 VHH（rVHH）。圖 1 所示的長(zhǎng) CDR（互補(bǔ)決定區(qū)）是 VHH 域的特征，使 VHH 抗體能夠進(jìn)入常規(guī)抗體無(wú)法到達(dá)的抗原位點(diǎn)。

非典型免疫球蛋白

駱駝科動(dòng)物（羊駝、駱駝等）除了常規(guī)的 IgG1 外，還產(chǎn)生兩種非典型的免疫球蛋白。IgG2 和 IgG3 被稱為重鏈免疫球蛋白。它們具有單域結(jié)合位點(diǎn)（VHH），不包含 CH1 域或輕鏈（圖 1）。

圖 1：常規(guī) IgG、重鏈免疫球蛋白IgG和 VHH 域抗體。插圖：VHH 域抗體的空間填充和絲帶圖（PDB 1MEL），顯示 3 個(gè) CDR 環(huán)，其中較長(zhǎng)的 CDR3 環(huán)以橙色顯示。

VHH 抗體的優(yōu)勢(shì)

-治療優(yōu)勢(shì)：VHH 抗體能夠穿過血腦屏障并進(jìn)入其他難以到達(dá)的部位，因此可用于藥物遞送。它們?cè)谘褐星宄杆伲瑢?duì)人類相對(duì)無(wú)免疫原性。良好的穩(wěn)定性使其可通過多種途徑遞送，包括靜脈注射、皮下注射、鼻吸入和口服。

-框架：12-15 kDa 的抗原結(jié)合 VHH 域作為重組抗體生產(chǎn)的框架。VHH 抗體可以設(shè)計(jì)成多種結(jié)構(gòu)形式。

-靶向：VHH 抗體的小尺寸和長(zhǎng) CDR3 環(huán)使其比傳統(tǒng)抗體更容易接近隱蔽的表位。

-穩(wěn)定性：VHH 抗體具有良好的溶解性，對(duì)熱、蛋白酶和極端 pH 值穩(wěn)定。

-生產(chǎn)：VHH 抗體易于克隆和修飾。它們可以在細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中以高水平重組生產(chǎn)。其設(shè)計(jì)可以包括用于純化的標(biāo)簽，或用于添加藥物或熒光探針的功能基團(tuán)。

抗 VHH 抗體

Jackson 抗羊駝二抗旨在優(yōu)化檢測(cè)源自駱駝科動(dòng)物（羊駝和駱駝）的抗體。其開發(fā)了多種試劑，以促進(jìn)通過多種技術(shù)識(shí)別 VHH 抗體，包括：

-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

-免疫印跡（Western Blotting）

-流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry）

-免疫熒光（Immunofluorescence）

多克隆二抗的效用在于其能夠識(shí)別目標(biāo)（一抗）免疫球蛋白上的多個(gè)表位。通過用羊駝的 VHH 片段（從純化的重鏈免疫球蛋白中獲得）免疫山羊，獲得抗 VHH 域抗體。我們已經(jīng)證明，這些多克隆抗體能夠穩(wěn)健地識(shí)別羊駝和駱駝 VHH。然而，一些重組 VHH 可能不會(huì)顯示許多存在于天然 VHH 片段上的抗原，這使得這些二抗難以檢測(cè)。

多功能檢測(cè) VHH 抗體，不受物種或形式限制

重組納米抗體通常是從羊駝或駱駝重鏈抗體的 VHH 結(jié)構(gòu)域框架中生成的。JIR 抗羊駝 VHH 結(jié)構(gòu)域抗體旨在檢測(cè)駱駝科物種在天然和變性條件下的 VHH 框架。WB（圖 2）顯示，抗羊駝 VHH 在變性狀態(tài)下檢測(cè)到羊駝和駱駝的 VHH 框架。遷移的差異反映了 VHH 抗體結(jié)構(gòu)的差異，特別是 VHH 二聚體 L4*。

如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（圖 3）所示，抗羊駝 VHH 抗體識(shí)別羊駝和駱駝 rVHH 的天然形式。不同 rVHH 構(gòu)建體的信號(hào)強(qiáng)度不同，表明某些 rVHH 并未表達(dá)存在于免疫原（來(lái)自未免疫羊駝的 VHH 片段）上的表位。

圖 2：不同羊駝和駱駝 rVHH 域抗體的西方印跡。在還原條件下，純化的 rVHH（每孔 1μg）經(jīng) PAGE 電泳并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用牛血清白蛋白（BSA，貨號(hào) 001-000-162）封閉印跡，并以 1:20K 稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗羊駝 VHH（128-035-232）進(jìn)行探針檢測(cè)。使用 ECL 進(jìn)行檢測(cè)。

圖 3：通過 ELISA 檢測(cè)來(lái)自羊駝或駱駝的 VHH 抗體。每種 rVHH 以 10 μg/ml 涂布于 ELISA 板，并用辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗羊駝 VHH（128-035-230 或 128-035-232）和 TMB 底物進(jìn)行檢測(cè)。

在大多數(shù)情況下，128-035-232 比 128-035-230 提供更強(qiáng)的信號(hào)，因?yàn)樗鼘?duì)較少物種進(jìn)行了交叉吸附。選擇抗體特異性時(shí)應(yīng)考慮預(yù)期應(yīng)用：如果物種交叉反應(yīng)不是問題，則使用 128-035-232 以獲得更高的靈敏度。

間接檢測(cè)以增強(qiáng)信號(hào)

在 VHH 抗體與其靶標(biāo)結(jié)合后，使用二抗進(jìn)行檢測(cè)是標(biāo)記導(dǎo)向檢測(cè)的替代方法。二抗提供信號(hào)增強(qiáng)和更多的偶聯(lián)選項(xiàng)。

免疫分析格式分析可以設(shè)置為多種形式，包括直接、間接、夾心和競(jìng)爭(zhēng)。間接和夾心分析是更常用的格式。它們通過偶聯(lián)二抗增強(qiáng)來(lái)自目標(biāo)分子的信號(hào)，從而提供更高水平的靈敏度。

圖4 A：通過 ELISA 檢測(cè)羊駝 rVHH 抗人 IgG 一抗。將純化的重組 GFP（rGFP）以 10 μg/ml 涂布于 ELISA 板。用牛血清白蛋白（BSA，貨號(hào) 001-000-162）封閉孔，并用幾種 rVHH 抗 GFP 一抗的連續(xù)稀釋液進(jìn)行探針檢測(cè)。用辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗羊駝 VHH（128-035-232）和 TMB 底物檢測(cè)一抗。

圖 4 B：顯示檢測(cè)羊駝 rVHH 抗 GFP 一抗的WB。兩種不同的純化 rGFP（每孔 0.5 μg）在還原條件下經(jīng) PAGE 電泳并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用牛血清白蛋白（BSA，貨號(hào) 001-000-162）封閉印跡，并用 rVHH 抗 GFP 一抗進(jìn)行探針檢測(cè)，然后用 1:10K 稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗羊駝 VHH（128-035-232）進(jìn)行孵育。使用 ECL 進(jìn)行檢測(cè)。

在生物樣本中檢測(cè) VHH

VHH 開發(fā)的篩選階段以及下游應(yīng)用可能需要檢測(cè)。與在 VHH 的 N 端或 C 端添加標(biāo)簽相比，使用特定于 VHH 的二抗進(jìn)行直接檢測(cè)在許多應(yīng)用中具有優(yōu)勢(shì)。例如，使用抗 VHH 域抗體可以避免通過 His6 等純化標(biāo)簽進(jìn)行檢測(cè)，減少與具有標(biāo)簽表位同源性的內(nèi)源性蛋白的背景信號(hào)。

在WB中，羊駝 VHH 抗體能夠在其他蛋白存在下特異性地檢測(cè) rVHH。與抗 His6 抗體相比，羊駝 VHH 抗體在檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞裂解液中的重組蛋白時(shí)顯示出顯著較少的非特異性檢測(cè)（圖 5）。在純化前篩選或定量 VHH 表達(dá)的能力加快了發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)進(jìn)程。然而，VHH 相對(duì)于細(xì)胞裂解液中的總蛋白的量可能非常小，使得可靠表征變得困難。通過靶向 VHH 域，抗羊駝 IgG VHH 域抗體消除了猜測(cè)或標(biāo)簽的需求。如圖 6 所示，這些多克隆抗體能夠在細(xì)胞裂解液中以高靈敏度和特異性檢測(cè) VHH。

圖 5：比較大腸桿菌裂解液中目標(biāo)蛋白檢測(cè)的WB。大腸桿菌裂解液蛋白在還原條件下經(jīng) PAGE 電泳并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用牛血清白蛋白（BSA，貨號(hào) 001-000-162）封閉印跡，并以 1:5K 稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗 His6 抗體或辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗羊駝 VHH（128-035-232）進(jìn)行探針檢測(cè)。使用 ECL 進(jìn)行檢測(cè)，并同時(shí)成像印跡。泳道 1：僅 20 μg 大腸桿菌提取物；泳道 2：含 rVHH 表達(dá)的大腸桿菌提取物（占總蛋白的 5%，即 1 μg）；泳道 3：含 rVHH 表達(dá)的大腸桿菌提取物（占總蛋白的 1%，即 0.2 μg）。

圖 6：顯示在大腸桿菌蛋白裂解液中檢測(cè) rVHH 分析物的夾心 ELISA。將 AffiniPure? 羊抗羊駝 VHH（128-005-232）涂布于 ELISA 板作為捕獲抗體，隨后加入純化 rVHH 標(biāo)準(zhǔn)品或含 rVHH 分析物的大腸桿菌裂解液（占總蛋白的 1% 或 5%）。用辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗羊駝 VHH（128-035-232）和 TMB 底物檢測(cè) rVHH。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) VHH

重組 VHH 構(gòu)建體可能成為治療應(yīng)用的候選者，因此需要在動(dòng)物模型或患者中追蹤它們的存在。山羊抗羊駝 VHH 抗體（例如，Alexa Fluor 488 偶聯(lián) 128-545-230）可用于檢測(cè)患者細(xì)胞上的 VHH，而不會(huì)識(shí)別內(nèi)源性 IgG 或源自小鼠、兔或大鼠的一抗。

目前的腫瘤學(xué)研究在多種 T 細(xì)胞重定向策略中采用 VHH 技術(shù)，以利用患者自身的免疫防御。這些策略包括生成雙特異性格式以招募和激活細(xì)胞毒性或 γδ T 細(xì)胞，設(shè)計(jì)基于納米抗體的嵌合抗原受體（CAR）T 細(xì)胞，以及開發(fā)免疫檢查點(diǎn)阻斷納米抗體。通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)修飾的 T 細(xì)胞進(jìn)行表征，通常允許分選和擴(kuò)增表達(dá) CAR 的細(xì)胞。

圖 7：使用羊駝 VHH 抗人 IgG 和 Alexa Fluor 488 羊抗羊駝 VHH 間接檢測(cè)淋巴細(xì)胞上的人 IgG。

我們使用多克隆羊駝 VHH 抗人 IgG（而非 CAR）來(lái)展示 128-545-230 在流式細(xì)胞術(shù)中的效用。相鄰的圖代表在淋巴細(xì)胞上設(shè)置的樣本。羊抗羊駝 VHH 不識(shí)別小鼠抗 CD19，并且僅在存在 VHH 抗人 IgG 時(shí)檢測(cè)人 IgG。

使用 VHH 抗體進(jìn)行成像

使用 VHH 抗體進(jìn)行檢測(cè)需要熒光探針或酶等報(bào)告分子來(lái)可視化目標(biāo)蛋白。偶聯(lián)的山羊抗羊駝 VHH 抗體提供了間接檢測(cè)的固有優(yōu)勢(shì)，如信號(hào)增強(qiáng)和偶聯(lián)選擇。

抗羊駝 IgG 二抗

圖 8：HEp-2 細(xì)胞的 Ki-67 和微管雙重標(biāo)記。HEp-2 細(xì)胞采用以下組合進(jìn)行染色：兔抗 Ki-67，羊駝抗兔多克隆 VHH，以及 Alexa Fluor 488 偶聯(lián)山羊抗羊駝 IgG VHH 域（128-545-230）（綠色）；小鼠抗微管和 RRX 偶聯(lián)山羊抗小鼠 IgG（115-295-146）（紅色）。使用 DAPI 進(jìn)行核染色（藍(lán)色）。

山羊抗羊駝 IgG VHH 域（最少牛、人、小鼠、兔和大鼠血清蛋白）已對(duì)常見宿主物種進(jìn)行交叉吸附，以最小化背景和非靶標(biāo)標(biāo)記。

產(chǎn)品推薦表格：