杜克大學：在模式觸發免疫中，PABP/富含嘌呤基序作為帽非依賴性翻譯的起始模塊

大多數真核mRNAs以典型的帽依賴性方式翻譯。為了啟動翻譯，三元復合物 (eIF2-GTPMet-tRNAi)被裝載到40S核糖體亞單位上，形成43S預起始復合物 (PIC)，然后通過由帽結合蛋白eIF4E、支架蛋白eIF4G和RNA解旋酶eIF4A組成的eIF4F復合物被招募到mRNA的m7G封端5’端。聚 (A)結合蛋白 (PABP)促進了43S PIC向50帽的募集，該蛋白通過與eIF4F復合物中的eIF4G相互作用，從mRNA的30聚 (A)尾環回。在對應激的反應中，通常通過應激誘導的eIF2a磷酸化來抑制一般翻譯的啟動，這降低了活性三元復合物的可用性。某些應激反應性mRNAs，例如酵母中的一般控制非抑制性4 (GCN4)和哺乳動物中的激活轉錄因子4 (ATF4)，其翻譯通常受到其mRNAs中上游開放閱讀框 (uORFs)的抑制，優先翻譯三元復合物的水平降低。然而，在植物中，盡管在包括模式觸發免疫 (PTI)在內的許多應激反應中觀察到eIF2a磷酸化，但在GCN2突變體中阻斷這一過程對生物和非生物應激反應沒有影響。

2022年7月29日，來自美國杜克大學的Jinlong Wang及其團隊在Cell (IF: 38.637)雜志上發表名為PABP/purine-rich motif as an initiation module for cap-independent translation in pattern-triggered immunity的研究。

本文研究了植物在應對病原體感染時的翻譯調控機制，特別是模式觸發免疫（PTI）信號通路如何通過非帽依賴性翻譯機制促進應激誘導的翻譯組重編程。傳統的翻譯起始通常依賴于mRNA的5'端的帽子結構（m7G-cap），然而在植物中，PTI信號通路并不依賴于GCN2/eIF2α通路來抑制一般翻譯，而是通過一種非帽依賴性翻譯機制選擇性翻譯防御相關mRNA。這種機制對于植物在應對生物和非生物脅迫時快速調整翻譯組，優先合成防御蛋白至關重要。

研究亮點

1、PTI利用R基序作為IRES效應來誘導mRNA的脫帽和防御mRNA的翻譯。

2、PABPs 通過與 eIFiso4G 的關聯而不是 eIF4G 激活 R 基序介導的翻譯。

3、MPK3/6在PTI期間使用RACK1作為支架磷酸化eIF4G、PABP和eIF4G。

4、磷酸化抑制eIF4G，同時激活PABP/eIF4G介導的翻譯。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.037

實驗材料與試劑：

實驗材料：擬南芥（Arabidopsis thaliana）和本氏煙草（Nicotiana benthamiana）植株。

試劑：Synaptic Systems品牌的anti-m7G-cap mouse monoclonal antibody（貨號：SYS-201-011）用于檢測mRNA的帽子結構，以及其他用于分子生物學和生物化學實驗的常規試劑。

實驗結果：

mRNA脫帽活性檢測：實驗發現，在elf18（一種細菌延伸因子Tu的N端表位）誘導下，植物體內mRNA的脫帽活性顯著增加，特別是防御相關mRNA如TBF1的脫帽程度顯著高于看家基因UBQ10。這表明PTI信號通路通過增加mRNA脫帽活性來抑制一般翻譯，同時選擇性促進防御mRNA的翻譯。

R-motif作為內部核糖體進入位點（IRES）的功能驗證：通過突變TBF1 mRNA 5'UTR中的R-motif，發現這些突變顯著降低了elf18誘導的翻譯活性，表明R-motif在促進防御mRNA翻譯中起關鍵作用。體外翻譯實驗進一步證實了R-motif可以不依賴于帽子結構促進mRNA翻譯。

PABP與eIF4G及eIFiso4G的相互作用：分裂熒光素酶互補實驗和Co-IP實驗表明，PABP在elf18誘導下優先與eIFiso4G結合，而與eIF4G的結合減弱。這表明PABP通過動態調整與不同eIF的結合來促進防御mRNA的翻譯。

磷酸化分析：使用phos-tag凝膠電泳和LC-MS/MS分析發現，elf18誘導下PABP、eIF4G和eIFiso4G發生磷酸化修飾。特別是PABP的S566位點被MPK3/6激酶磷酸化，增強了其與R-motif的結合能力。磷酸化位點的突變體實驗進一步證實了磷酸化在調控PABP功能中的重要性。

植物抗病性測試：通過接種病原細菌測試發現，PABP、eIF4G和eIFiso4G的突變體植物在PTI誘導的抗病性方面表現出不同表型。特別是eIFiso4G的突變顯著降低了植物的抗病性，而eIF4G的突變則增強了基礎抗性但不影響PTI誘導的抗病性。

結論

本研究揭示了植物在應對病原體感染時通過一種新穎的非帽依賴性翻譯機制來快速調整翻譯組，優先合成防御蛋白。這一過程涉及mRNA的脫帽、R-motif作為IRES促進翻譯、PABP與不同eIF的動態相互作用以及MPK3/6激酶介導的磷酸化修飾。這些發現不僅增進了我們對植物免疫機制的理解，也為未來開發新型植物保護策略提供了理論依據。

Synaptic Systems品牌的anti-m7G-cap mouse monoclonal antibody（貨號：SYS-201-011）在本研究中發揮了關鍵作用，主要體現在以下幾個方面：

mRNA脫帽活性的量化：該抗體能夠特異性識別mRNA的5'端帽子結構（m7G-cap），通過免疫沉淀（IP）結合qPCR技術，可以準確量化mRNA的脫帽程度。這對于評估PTI信號通路對mRNA穩定性的影響至關重要。 

驗證非帽依賴性翻譯機制：在研究非帽依賴性翻譯機制時，需要排除帽子結構對翻譯的影響。該抗體能夠幫助確認mRNA是否確實失去了帽子結構，從而支持R-motif作為IRES功能的結論。 

提高實驗的可靠性和準確性：使用高質量的特異性抗體可以減少非特異性結合和背景信號干擾，提高實驗數據的可靠性和準確性。這對于科學研究來說至關重要，尤其是在探索復雜生物過程的分子機制時。 

促進相關領域的研究發展：該抗體的應用不僅限于本研究領域，還可以推廣到其他涉及mRNA穩定性和翻譯調控的研究中。隨著對mRNA代謝和翻譯調控機制理解的深入，該抗體將成為更多相關研究中的重要工具。 

Synaptic Systems品牌的m3G-cap, m7G-cap antibody - 201 011，在本研究中發揮了不可或缺的作用，不僅幫助揭示了植物PTI信號通路中的新型翻譯調控機制，還為相關領域的研究提供了有力支持。