Biotium-EvaEZ熒光聚合酶活性檢測(cè)試劑盒提供了一種簡(jiǎn)單易行的在不使用核酸聚合酶的情況下確定核酸聚合酶活性的準(zhǔn)確方法放射性同位素。它含有EvaGreen染料和底漆模板dNTP，氯化鎂以及Tris緩沖系統(tǒng)中的ROX參考染料（高ROX）。在場(chǎng)時(shí)當(dāng)DNA聚合酶活性降低時(shí)，引物將延伸形成雙鏈可以結(jié)合EvaGreen染料的產(chǎn)品，從而增加熒光（圖1）。熒光增加率與聚合酶活性（見(jiàn)方案B中的示例）。該檢測(cè)方法已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)用于測(cè)量Taq DNA聚合酶活性。它也可以用于其他DNA聚合酶，如Pfu、Vent、Phusion、Bst、Phi29、MMLV、AMV，SuperScript、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Klenow和大腸桿菌DNA聚合酶I。活性測(cè)定可以在4°C至75°C。

圖1：EvaEZ熒光聚合酶活性測(cè)定的示意圖概述

圖2：EvaEZ熒光聚合酶活性測(cè)定的典型反應(yīng)曲線

艾美捷Biotium-EvaEZ熒光聚合酶活性檢測(cè)試劑盒（29051）推薦協(xié)議：適用于具有基本酶動(dòng)力學(xué)和活性測(cè)定知識(shí)的研究人員。

協(xié)議A描述了如何通過(guò)聚合測(cè)定熒光變化。

協(xié)議B和C描述了兩種不同的方法，使用聚合產(chǎn)生的熒光變化來(lái)計(jì)算聚合酶活性單位。

協(xié)議A：通過(guò)聚合測(cè)量熒光變化。

1. 在冰上的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)管中組合以下組分：

10 μL 2X EvaEZ聚合酶活性混合液

9 μL H2O

1 μL DNA聚合酶樣品

輕輕混合反應(yīng)組分。

2. 快速將反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)定量PCR儀器中。在被測(cè)試聚合酶的指定溫度下運(yùn)行等溫程序（例如Klenow的37°C）60分鐘。在通道1（即FAM或EvaGreen的通道）測(cè)量熒光。

3. 圖2中的線A是實(shí)時(shí)定量PCR儀器（例如ABI 7900）記錄的典型反應(yīng)跡線。X軸是分鐘數(shù)；Y軸是熒光。制作一條通過(guò)時(shí)間0的線B。由聚合酶活性產(chǎn)生的熒光變化的初始速率（熒光單位/分鐘）由線B的斜率表示。

注意1：根據(jù)使用的儀器，聚合開(kāi)始時(shí)間和開(kāi)始收集熒光的時(shí)間可能有延遲。

注意2：反應(yīng)也可以在可以準(zhǔn)確控制溫度的熒光計(jì)比色皿或板式讀取器中進(jìn)行。

協(xié)議B：基于聚合酶標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定未知聚合酶樣品的活性。

1. 制作已知活性的標(biāo)準(zhǔn)DNA聚合酶的系列稀釋。

2. 使用協(xié)議A監(jiān)測(cè)每種稀釋的熒光。

3. 通過(guò)計(jì)算曲線初始線性部分的斜率來(lái)確定每種聚合酶稀釋的熒光增加的初始速率（參見(jiàn)協(xié)議A，步驟3和圖2）。

4. 將每種標(biāo)準(zhǔn)稀釋的初始斜率與標(biāo)準(zhǔn)DNA聚合酶的單位活性繪制對(duì)比，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5. 使用步驟4中的線性范圍作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用協(xié)議A測(cè)量未知聚合酶樣品的初始速率。

? 如果速率落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未知聚合酶樣品的活性。

? 如果速率超出線性范圍，調(diào)整未知聚合酶樣品的濃度，使初始速率進(jìn)入標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍。在計(jì)算活性時(shí)考慮稀釋因子。

協(xié)議C：基于合成的核苷酸數(shù)量測(cè)定未知聚合酶樣品的活性。

1. 制作未知DNA聚合酶的系列稀釋，并根據(jù)協(xié)議A測(cè)量初始速率。

2. 從稀釋系列中選擇一個(gè)在線性響應(yīng)區(qū)域中的酶濃度，并按照協(xié)議A描述確定初始熒光變化的斜率。

ΔF = 斜率（熒光單位/分鐘）* 60（分鐘）

3. 分別，使用飽和酶濃度和無(wú)酶對(duì)照組按照協(xié)議A中描述的程序運(yùn)行聚合反應(yīng)。

4. 通過(guò)從無(wú)酶對(duì)照組的第60分鐘熒光中減去飽和酶的第60分鐘熒光，得出最大熒光變化（ΔFmax）。

在60分鐘內(nèi)，在試劑盒條件下選定濃度的聚合酶合成的核苷酸數(shù)量為：

(ΔF/ΔFmax) * 270 pmole

注意：270 pmol是在20 μL EvaEZ反應(yīng)中飽和酶合成的核苷酸數(shù)量。

儲(chǔ)存和搬運(yùn)：

將試劑盒儲(chǔ)存在室溫下。套件組件自日期起穩(wěn)定一年按照建議存儲(chǔ)時(shí)收到收據(jù)。結(jié)合緩沖液含有離液硫氰酸胍鹽，具有刺激性。使用手套和其他合適的使用此試劑盒時(shí)的實(shí)驗(yàn)室保護(hù)。漂白劑與硫氰酸胍混合會(huì)產(chǎn)生有害的副產(chǎn)品。請(qǐng)勿將凝膠提取試劑盒中的廢物與漂白劑。

檢測(cè)協(xié)議：

在使用前，請(qǐng)確保向洗滌緩沖液濃縮液中加入100%未變性乙醇。對(duì)于31030-50，向10 mL洗滌緩沖液濃縮液中加入40 mL乙醇。對(duì)于31030-250，向55 mL洗滌緩沖液濃縮液中加入220 mL乙醇。離心步驟應(yīng)在常規(guī)臺(tái)式微量離心機(jī)中以17,900 x g（大約10,000 rpm）進(jìn)行。

1. 使用干凈的鋒利工具，如手術(shù)刀，切除含有感興趣DNA片段的瓊脂糖凝膠切片。稱量凝膠切片，記錄重量，并將凝膠切片轉(zhuǎn)移到1.7 mL微量離心管中。

2. 向1體積的凝膠切片中加入3體積的結(jié)合緩沖液（100 mg大約等于100 μL）。

3. 在50°C下孵化凝膠切片和結(jié)合緩沖液10分鐘，或直到凝膠切片完全溶解。在此孵化過(guò)程中偶爾漩渦混合將加速溶解過(guò)程。

4. 在凝膠完全溶解后檢查溶液的顏色。如果是黃色，溶液的pH值適合DNA結(jié)合到柱子上。然而，如果溶液呈橙色、紅色或紫色，只需向溶液中加入少量3 M醋酸鈉pH 5.0，直到顏色恢復(fù)為黃色。

5. 為了更有效地回收小于500 bp或大于4 kb的片段，向管中加入1體積的異丙醇并混合。

6. 將樣品吸入提供的柱子中，放入收集管中，離心1分鐘。如果有多余的樣品，只需分幾輪處理，確保將額外的樣品應(yīng)用到相應(yīng)的柱子上。

7. 丟棄流穿液，并將現(xiàn)在含有結(jié)合DNA的柱子放回收集管中。

8. 向柱子中加入750 μL洗滌緩沖液（確保已加入乙醇），并離心1分鐘。

9. 丟棄流穿液，將柱子放回收集管中。再離心1-5分鐘以去除柱子中殘留的乙醇。

10. 小心地取下柱子，放入干凈的1.5 mL微量離心管中。

11. 向柱子中心加入30-50 μL洗脫緩沖液。孵化1分鐘，然后離心1分鐘以收集純化后的DNA。

12. 將洗脫的DNA儲(chǔ)存在-20°C。

Biotium-EvaEZ熒光聚合酶活性檢測(cè)試劑盒文獻(xiàn)參考：

1. Irwin H. Segel, I. H. Segel. Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems. 1976.

2. Mao F, Leung WY, Xin X. (2007). Characterization of EvaGreen and the implication of its physicochemical properties for qPCR applications. BMC Biotechnol. 7, 76.

Biotium致力于開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)用于生物醫(yī)學(xué)研究的熒光指示劑及其他特殊生化產(chǎn)品。其產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生 物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、診斷學(xué)、生物化學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、血液流動(dòng)檢測(cè)及大規(guī)模藥物篩選等眾多領(lǐng)域。艾美捷科技是Biotium的中國(guó)代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。