ELISpot和FluoroSpot免疫檢測方法在傳染病研究中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們能夠在細胞水平上檢測免疫反應(yīng)，幫助研究者理解各種感染背后的免疫機制。下文探討了Mabtech免疫檢測方法在重大傳染病研究中的應(yīng)用，包括結(jié)核病（TB）、SARS-CoV-2、瘧疾、艾滋病（HIV）、猴痘（Mpox）、蜱傳腦炎（TBE）、萊姆病、流感、巨細胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）和BK病毒。

免疫系統(tǒng)對抗病原體的能力在很大程度上依賴于細胞免疫，特別是T細胞的作用以及它們分泌細胞因子以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的能力。像ELISpot和FluoroSpot這樣的免疫檢測方法能夠定量分析單個細胞水平上分泌細胞因子的細胞，非常適合用于研究針對感染性病原體的免疫反應(yīng)。通過捕獲單個細胞釋放的細胞因子或其他免疫相關(guān)分子，這些免疫檢測方法使研究人員能夠研究針對病原體的特異性免疫反應(yīng)，用于診斷以及疫苗開發(fā)。

結(jié)核病（TB）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的，仍然是全球最嚴重的傳染病之一。在結(jié)核病免疫研究中，ELISpot的使用帶來了極大的益處，尤其是在監(jiān)測T細胞反應(yīng)方面。ELISpot檢測，尤其是針對干擾素-γ（IFN-γ）的檢測，常用于疫苗開發(fā)和診斷。例如，IFN-γ ELISpot檢測已被廣泛用于通過測量針對特定結(jié)核分枝桿菌抗原（如ESAT-6和CFP-10）的干擾素-γ釋放來檢測潛伏性結(jié)核感染。因此，ELISpot在結(jié)核病診斷中是一種干擾素-γ釋放試驗（IGRA）。需要注意的是，IGRA也可以基于ELISA進行。然而，無論IGRA是基于何種檢測方法，許多醫(yī)療服務(wù)提供者都已意識到IGRA相比經(jīng)典的結(jié)核菌素試驗（TST）在診斷上的優(yōu)勢，因為TST可能會在接種過卡介苗（BCG）疫苗的人群中產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

ELISpot檢測已經(jīng)可以適應(yīng)多種結(jié)核特異性抗原的檢測，從而提高診斷的準(zhǔn)確性。例如，Mabtech ELISpot Path試劑盒（貨號3420-2AST-P4-1，ELISpot Path: TB (ESAT6+CFP10+EspC) Human IFNγ），除了傳統(tǒng)的ESAT-6和CFP-10抗原外，還加入了EspC抗原。如果未來非BCG疫苗開始包含ESAT-6和/或CFP-10，那么現(xiàn)有的IGRAs將無法區(qū)分接種疫苗者和被感染者，這種第三種抗原在診斷中可能會派上用場。為了加速對結(jié)核病的研究，Mabtech還可以提供多種結(jié)核分枝桿菌肽庫：TB (EspC)，掃描肽庫（貨號3623-1）；TB (ESAT-6)，掃描肽庫（貨號3624-1）；TB (CFP-10)，掃描肽庫（貨號3625-1）。

細胞因子IFN-γ是用于一般免疫反應(yīng)的良好生物標(biāo)志物，但通過研究替代蛋白，或許可以獲得更多詳細信息。卡羅林斯卡學(xué)院的Christopher Sundling及其團隊利用Olink的探索性多重檢測技術(shù)，識別出一種包含12種蛋白質(zhì)的血漿標(biāo)志物，這種標(biāo)志物在患有肺結(jié)核和肺外結(jié)核的個體中高度富集，并且與疾病嚴重程度相關(guān)。在12種蛋白質(zhì)中，差異最顯著的4種是IFN-γ、IL-6、VEGF和IP-10，這些發(fā)現(xiàn)得到了之前多項蛋白質(zhì)組學(xué)研究的證實：IFN-γ水平在活動性結(jié)核病期間升高；IL-6與活動性結(jié)核病和空洞型結(jié)核病相關(guān)；VEGF促進血管生成，可由結(jié)核病肉芽腫中的巨噬細胞產(chǎn)生。最后，IP-10（干擾素-γ誘導(dǎo)蛋白10）作為一種診斷生物標(biāo)志物，可能比IFN-γ更敏感，因為該蛋白是IFN-γ下游誘導(dǎo)的，理論上信號可以被放大。為了在單細胞水平上研究例如IP-10，推薦Mabetch的ELISpot Plus：IP-10試劑盒（貨號3401-4APW-2， ELISpot Plus: Human IP-10 (ALP)）。

綜上所述，新的肽庫以及新的生物標(biāo)志物對于改進結(jié)核病診斷和疫苗開發(fā)具有重要意義。使用FluoroSpot或基于微珠的多重平臺等多重檢測工具，可以提供關(guān)于疾病狀態(tài)和嚴重程度的更豐富信息，并有助于指導(dǎo)治療和加強結(jié)核病防控。

新冠病毒（SARS-CoV-2）

由SARS-CoV-2引起的新冠疫情促使人們迅速加大了對病毒免疫反應(yīng)的研究力度。ELISpot檢測已被廣泛用于評估針對SARS-CoV-2的T細胞反應(yīng)，為自然感染和疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)提供了關(guān)鍵信息。有研究使用了FluoroSpot Path：SARS-CoV-2（S1scan+SNMO）人IFN-γ/IL-2試劑盒（貨號FSP-0102-P1-1），以檢測對SARS-CoV-2特異性抗原（包括刺突蛋白（S）、核衣殼蛋白（N）和膜蛋白（M））產(chǎn)生細胞因子IFN-γ和IL-2的T細胞。研究結(jié)果表明，從新冠感染中康復(fù)的個體通常具有強大的T細胞反應(yīng)，這可能在長期保護中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

除了T細胞反應(yīng)外，體液反應(yīng)當(dāng)然也很重要，Mabtech強調(diào)的是，僅僅研究抗體滴度是不夠的。盡管抗體水平可能會隨時間下降，但記憶B細胞可以持續(xù)存在，而要全面了解個體的免疫力，記憶B細胞可以通過B細胞ELISpot或FluoroSpot輕松進行研究。實際上，很少有其他技術(shù)能夠如此直接地檢測記憶B細胞反應(yīng)。卡羅林斯卡學(xué)院的一個研究小組使用Mabtech的ELISpot Path：SARS-CoV-2（RBD）人IgG（ALP）（貨號3850-4APW-R1-1），發(fā)現(xiàn)即使抗體滴度下降，記憶B細胞反應(yīng)仍然持續(xù)存在。

瘧疾（Malaria）

瘧疾是由瘧原蟲（Plasmodium parasites）引起的，是世界上許多地區(qū)發(fā)病率和死亡率的主要原因之一。FluoroSpot和ELISpot在瘧疾研究中發(fā)揮了重要作用，尤其是在評估實驗性疫苗的免疫反應(yīng)方面。瘧原蟲及其生命周期的復(fù)雜性意味著，細胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)對于保護都非常重要。ELISpot測定IFN-γ（貨號3420-4AST-2, ELISpot Plus: Human IFN?γ (ALP)）產(chǎn)生的方法在瘧疾疫苗試驗中極為有用，因為它們有助于量化針對瘧原蟲生命周期中肝臟階段和血液階段抗原的T細胞反應(yīng)。此外，ELISpot還被用于研究流行地區(qū)人群的自然獲得性免疫，為了解哪些免疫反應(yīng)與保護相關(guān)提供了見解。

為了研究針對多種抗原的體液反應(yīng)，一種反轉(zhuǎn)的B細胞FluoroSpot檢測方法能夠在單細胞水平上對瘧疾特異性B細胞進行多重分析。所謂“反轉(zhuǎn)”，是指先用抗IgG抗體包被平板，然后通過帶有標(biāo)簽的抗原檢測抗原特異性IgG，再使用熒光素偶聯(lián)的抗標(biāo)簽試劑進行檢測。這種方法可以在同一樣本中同時分析針對多種抗原特異性或交叉反應(yīng)性的B細胞，從而節(jié)省寶貴的細胞資源。

艾滋病（HIV）

艾滋病毒感染對免疫系統(tǒng)提出了重大挑戰(zhàn)，尤其是在其逃避免疫細胞的檢測和抑制方面。ELISpot檢測在艾滋病毒研究中被廣泛用于監(jiān)測T細胞反應(yīng)，并理解感染期間免疫激活的動態(tài)變化。盡管我們目前仍未擁有有效的艾滋病毒疫苗，但ELISpot為我們提供了寶貴的信息，幫助我們了解T細胞反應(yīng)如何與病毒復(fù)制的控制和疾病進展相關(guān)聯(lián)。20世紀(jì)90年代初期的艾滋病毒疫苗開發(fā)工作促成了ELISpot的聲名鵲起。正是在這些項目中，IFN-γ ELISpot被確立為一種出色的工具和評估疫苗效力的黃金標(biāo)準(zhǔn)。

猴痘（和牛痘）

猴痘（Mpox，之前稱為猴天花）是一種與天花類似的正痘病毒，近年來由于在不同地區(qū)零星暴發(fā)而受到關(guān)注。ELISpot檢測已被應(yīng)用于研究猴痘感染或針對正痘病毒的疫苗接種后的免疫反應(yīng)。通過研究T細胞免疫反應(yīng)（如IFN-γ分泌），ELISpot和FluoroSpot有助于描述疫苗接種者和自然感染者T細胞反應(yīng)的持久性和有效性。

研究猴痘（Mpox）反應(yīng)的一種方法是用天花病毒（Vaccinia virus）的肽庫刺激外周血單個核細胞（PBMCs）。天花病毒是一種與天花和猴痘相關(guān)的痘病毒，通常用于天花疫苗接種。Mabtech有兩種天花病毒肽庫（PepPools），可以用于這一特定應(yīng)用：一種用于研究CD4反應(yīng)（貨號3635-1，PepPool: Vaccinia (CD4), human），另一種用于研究CD8反應(yīng)（貨號3670-1，PepPool: Vaccinia (CD8), human）。這兩種肽庫均已在臨床樣本上成功驗證，并且在一名感染猴痘的個體以及一名在2022年接種了新型猴痘疫苗的個體中均檢測到了IFN-γ反應(yīng)。

蜱傳腦炎（TBE）

TBE是由TBEV黃病毒引起的，在歐洲和亞洲的大部分地區(qū)通過蜱傳播。ELISpot在研究對TBEV的免疫反應(yīng)，特別是在疫苗研究中發(fā)揮了重要作用。廣泛應(yīng)用于流行地區(qū)的TBE疫苗，已經(jīng)使用ELISpot進行了研究，以評估其誘導(dǎo)強大T細胞反應(yīng)的能力。IFN-γ ELISpot檢測已用于測量細胞對TBE病毒抗原的反應(yīng)，從而深入了解免疫系統(tǒng)如何抵抗這種病毒以及接種疫苗后如何建立長期免疫。Mabtech開發(fā)了一種Path試劑盒（貨號3420-4AST-P8-1，ELISpot Path: TBEV (C+E) Human IFN-γ），其中包括一個肽庫，由75個從TBEV衍生的合成肽組成，非常適合研究IFN-γ對TBE的反應(yīng)。

萊姆病（伯氏疏螺旋體感染）

蜱蟲不僅是病毒的攜帶者，如上文提到的TBEV，也是細菌的攜帶者。萊姆病（Lyme disease），也稱為伯氏疏螺旋體病（Borreliosis），是由攜帶伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）細菌的蜱蟲叮咬引起的。了解對伯氏疏螺旋體的免疫反應(yīng)對于改進診斷、治療和預(yù)防策略至關(guān)重要。盡管血清學(xué)檢測是標(biāo)準(zhǔn)的診斷方法，但針對萊姆病免疫的研究越來越多地轉(zhuǎn)向細胞檢測，包括ELISpot，以深入了解T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。

具體來說，ELISpot檢測通過能夠檢測對伯氏疏螺旋體抗原（如外表面蛋白A，OspA）產(chǎn)生反應(yīng)的T細胞而被證明是有用的，而OspA是疫苗研究中的關(guān)鍵靶點。目前還沒有廣泛可用的萊姆病疫苗，但通過測量對像OspA這樣的表面蛋白產(chǎn)生反應(yīng)的IFN-γ的產(chǎn)生，研究人員可以追蹤病原體特異性T細胞的存在和強度。這在區(qū)分早期和晚期感染，或者在評估實驗性疫苗的免疫反應(yīng)方面，尤其有價值。

此外，通過不僅檢測IFN-γ，還檢測IL-4和IL-17A，ELISpot或FluoroSpot有助于明確萊姆病中涉及的T輔助細胞反應(yīng)類型（Th1、Th2、Th17）。這一點至關(guān)重要，因為這些反應(yīng)的平衡可能會影響疾病的進展和嚴重程度。例如，強烈的Th1反應(yīng)可能與更好的細菌清除相關(guān)，而以Th2為主的反應(yīng)可能與持續(xù)感染或慢性癥狀有關(guān)。

最后，ELISpot已被用于研究慢性萊姆病（也稱為萊姆病后治療綜合征）的免疫反應(yīng)，在這種情況下，盡管進行了抗生素治療，癥狀仍然持續(xù)存在。盡管關(guān)于適應(yīng)性免疫在慢性萊姆病中的作用仍在討論中，但ELISpot檢測有助于探索持續(xù)的抗原特異性T細胞反應(yīng)是否會導(dǎo)致長期的免疫激活。

流感

流感是一種不斷演變的病毒威脅，需要每年更新疫苗。FluoroSpot和ELISpot檢測經(jīng)常用于流感研究，以了解T細胞對各種病毒株的反應(yīng)。除了評估季節(jié)性疫苗的效力外，ELISpot還用于研究通用流感疫苗，其目的是在多種菌株中提供更廣泛的保護。

在流感研究中，F(xiàn)luoroSpot檢測通常用于測量對病毒蛋白（通常是血凝素（HA）和核蛋白（NP））產(chǎn)生的IFN-γ和IL-2水平，揭示與流感保護相關(guān)的細胞免疫反應(yīng)的強度。2014年，Chauvat等人驗證了一種IFN-γ/IL-2（貨號FSP-0102-2，F(xiàn)luoroSpot Plus: Human IFN-γ/IL-2）和一種IFN-γ/IL-10 FluoroSpot（貨號FSP-0107-2， FluoroSpot Plus: Human IFN-γ/IL-10）檢測方法，用于臨床試驗疫苗監(jiān)測。

巨細胞病毒（CMV）

巨細胞病毒（CMV）是一種皰疹病毒，對于免疫受損人群（包括移植受者和艾滋病毒患者）來說是一個重大問題。這種病毒在我們大多數(shù)人體內(nèi)處于潛伏狀態(tài)，但當(dāng)宿主的免疫系統(tǒng)變?nèi)鯐r，它就會趁機活躍起來。IFN-γ ELISpot檢測被廣泛用于評估針對CMV的特異性T細胞反應(yīng)，幫助臨床醫(yī)生識別有CMV再激活風(fēng)險的個體，并指導(dǎo)抗病毒預(yù)防措施的決策。ELISpot還被用于旨在開發(fā)有效CMV疫苗策略的疫苗試驗中。

由于獼猴（如恒河猴和食蟹猴）在遺傳、免疫和生理方面與人類高度相似，它們被廣泛用作人類疾病的研究模型。值得注意的是，這些非人靈長類動物（NHPs）也可能感染CMV，這不僅會影響動物健康，還可能干擾生物醫(yī)學(xué)研究的結(jié)果。為解決這一問題，Mabtech開發(fā)了一種用于監(jiān)測這些動物感染情況的CyCMV+RhCMV肽庫（貨號3692-1，PepPool: CyCMV+RhCMV (TP?UL83+Rh112), scanning）。

Epstein-Barr病毒（EBV）

Epstein-Barr病毒是皰疹病毒家族的一員。由于EBV在B細胞中建立終生潛伏狀態(tài)，并且在某些情況下（通常是免疫受損時）能夠再激活，因此了解針對EBV的免疫反應(yīng)對于治療和診斷目的都至關(guān)重要。對于許多病毒感染，中和抗體是主要的防御手段，也是疫苗開發(fā)者追求的最終目標(biāo)。然而，在EBV的情況下，細胞毒性CD8 T細胞同樣重要，因為它們能夠靶向并殺死被感染的細胞。ELISpot檢測在研究針對EBV的T細胞反應(yīng)方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。具體來說，研究人員利用ELISpot來測量CD8 T細胞對EBV抗原（如LMP1和EBNA1）產(chǎn)生的IFN-γ。

此外，由于EBV影響B(tài)細胞，它還被認為可能是抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病（如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、干燥綜合征和多發(fā)性硬化癥（MS））的先決條件。最近的一項研究通過使用FluoroSpot和Mabtech IRIS展示EBV和MS抗原之間的T細胞交叉反應(yīng)性，進一步強化了EBV與MS之間的聯(lián)系。

為了便于開展針對EBV的T細胞反應(yīng)的基礎(chǔ)研究和臨床研究，Mabtech開發(fā)了一種經(jīng)過驗證的肽庫（貨號3641-1，PepPool: EBV (CD4 and CD8), human），它可以在FluoroSpot、ELISpot和流式細胞術(shù)中誘導(dǎo)CD8以及CD4反應(yīng)。為了讓研究更加便捷，Mabtech還專門開發(fā)了包含上述肽庫的EBV檢測試劑盒（3420-2AST-P5-1， ELISpot Path: EBV Human IFN-γ）。

BK病毒

BK病毒（BKV）是一種多瘤病毒，可能會引起嚴重的并發(fā)癥，尤其是在腎移植受者中，它可能導(dǎo)致與BK病毒相關(guān)的腎病（BKVAN）。通過檢測針對BK病毒特異性T細胞產(chǎn)生的IFN-γ，ELISpot檢測已成為預(yù)測BK病毒腎病風(fēng)險的寶貴工具。監(jiān)測這些細胞反應(yīng)有助于臨床醫(yī)生在免疫抑制治療的需求與病毒再激活的風(fēng)險之間取得平衡。

BK病毒感染非常普遍；超過80%的人在兒童早期就會感染。這種感染通常沒有癥狀，病毒會在體內(nèi)處于潛伏狀態(tài)，最常見的是在腎臟中。但在免疫受損的個體中，例如腎移植患者，BK病毒感染可能會變得有癥狀，并導(dǎo)致器官排斥。監(jiān)測針對BK病毒抗原的T細胞反應(yīng)對于預(yù)防病毒再激活及其相關(guān)并發(fā)癥至關(guān)重要。

在其他移植場景中，例如造血干細胞移植，ELISpot檢測已被用于評估免疫重建，為BK病毒特異性免疫的恢復(fù)提供見解，并幫助管理有嚴重BK病毒相關(guān)疾病風(fēng)險的患者。為了便于監(jiān)測BK病毒的免疫反應(yīng)，Mabtech開發(fā)了一種肽庫（貨號3675-1，PepPool: BKV (CD4 and CD8), human）及包含上述肽庫elispot檢測試劑盒（貨號3420-4AST-P9-1，ELISpot Path: BKV Human IFN?γ）。在監(jiān)測BK病毒時需要注意的是，它與JC病毒（John Cunningham病毒）有75%的序列相似性。JC病毒也是一種潛伏病毒，可在免疫受損個體中再激活，并導(dǎo)致進行性多灶性白質(zhì)腦病。因此，無論是好是壞，針對這兩種病毒的免疫反應(yīng)都可以通過肽庫進行檢測。

ELISpot和FluoroSpot因其在細胞水平檢測病原體特異性免疫反應(yīng)方面的高靈敏度和特異性而成為傳染病研究的寶貴工具。從研究自然免疫到評估疫苗功效，ELISpot和FluoroSpot有助于我們了解免疫系統(tǒng)如何與各種感染因子相互作用，包括TB， SARS-CoV-2，瘧疾，HIV, Mpox， TBE，萊姆病，流感，CMV， EBV和BK病毒。隨著免疫學(xué)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，ELISpot和FluoroSpot等免疫測定法仍將是追蹤免疫反應(yīng)的關(guān)鍵方法，有助于研究人員開發(fā)更有效的疫苗、診斷和治療方法來對抗傳染病。