FBXL10（F-box and leucine-rich repeat protein 10），又稱KDM2B、JHDM1B或CXXC2，是一種組蛋白賴氨酸去甲基化酶，能夠特異性催化組蛋白H3第4位三甲基賴氨酸（H3K4me3）和第36位二甲基賴氨酸（H3K36me2）的去甲基化反應(yīng)。作為多梳抑制復(fù)合物（PRC）的組成部分，F(xiàn)BXL10在細胞增殖、分化和遷移中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。研究表明，F(xiàn)BXL10在彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）中具有致癌活性，但在某些細胞類型中又表現(xiàn)為腫瘤抑制功能，提示其作用具有細胞類型依賴性。深入解析FBXL10的生物學(xué)功能及其在癌癥發(fā)生發(fā)展中的雙重角色，將為腫瘤治療提供新靶點和新策略。

為滿足科研人員在FBXL10酶活性檢測、抑制劑篩選及藥物發(fā)現(xiàn)中的需求，由艾美捷代理BPS Bioscience公司推出的FBXL10 (KDM2B) 均相檢測試劑盒（貨號：50610）提供了一套基于AlphaLISA技術(shù)的高靈敏度、高通量兼容的解決方案。該試劑盒以96孔或384孔板格式提供，包含純化的重組FBXL10酶、特異性抗體、生物素化底物及優(yōu)化緩沖液，支持100次或400次酶反應(yīng)，適用于酶動力學(xué)研究及小分子抑制劑的高通量篩選（HTS）。

圖1：FBXL10（KDM2B）均相檢測試劑盒原理。

首先，將含有FBXL10酶的樣本與生物素化底物一起孵育。接著，加入受體珠和一抗，然后加入供體珠。α計數(shù)與去甲基酶活性成正比。

一、檢測原理：基于AlphaLISA的均相免洗技術(shù)

本試劑盒采用AlphaLISA（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay） 技術(shù)，這是一種基于化學(xué)發(fā)光的均相檢測方法，無需洗滌步驟，具有極高的靈敏度和寬廣的動態(tài)范圍。

檢測流程分為兩個關(guān)鍵步驟：

第一步：酶催化去甲基化反應(yīng)。 將重組FBXL10酶與生物素化組蛋白H3肽底物（含H3K4me3或H3K36me2修飾）共同孵育。在酶活性存在下，底物上的甲基被移除，產(chǎn)生去甲基化的肽產(chǎn)物。

第二步：AlphaLISA信號檢測。 反應(yīng)結(jié)束后，依次加入：

兔源一抗：特異性識別去甲基化后的表位（即僅在甲基被移除后暴露的抗原表位）。

AlphaLISA Anti-Rabbit IgG Acceptor Beads（受體微球）：偶聯(lián)有抗兔IgG抗體。

AlphaScreen Streptavidin Donor Beads（供體微球）：通過鏈霉親和素與生物素化底物結(jié)合。

當(dāng)?shù)孜锉籉BXL10去甲基化后，一抗與去甲基化表位結(jié)合，進而通過二抗將受體微球招募至同一復(fù)合物。此時，供體微球（結(jié)合于底物的生物素端）與受體微球（結(jié)合于抗體端）在空間上相互靠近。在680 nm激光激發(fā)下，供體微球產(chǎn)生單線態(tài)氧；若兩種微球距離小于200 nm，單線態(tài)氧可傳遞至受體微球，觸發(fā)其發(fā)出615 nm的化學(xué)發(fā)光信號。發(fā)光強度與FBXL10的去甲基化酶活性成正比。若化合物抑制FBXL10活性，去甲基化產(chǎn)物減少，一抗無法結(jié)合，受體微球不能被招募，信號降低。

關(guān)鍵優(yōu)勢：AlphaLISA技術(shù)無需洗滌，操作簡單（“加樣-混合-孵育-讀數(shù)”），背景極低，靈敏度可達fmol級，動態(tài)范圍超過4個數(shù)量級，完美兼容自動化高通量篩選。

二、試劑盒核心組分與設(shè)計優(yōu)勢

1. 即用型完整組分（需自購Alpha微球）

試劑盒提供以下核心組分（注意：AlphaLISA受體微球和AlphaScreen供體微球需單獨向PerkinElmer購買）：

純化的重組人FBXL10（KDM2B）酶：保留完整去甲基化酶活性。

生物素化組蛋白H3肽底物：含特定甲基化修飾（H3K4me3或H3K36me2）。

兔源一抗：特異性識別去甲基化表位。

10× 檢測緩沖液：優(yōu)化pH和離子組成，確保酶反應(yīng)及AlphaLISA信號穩(wěn)定。

微孔板：可選OptiPlate-96或OptiPlate-384（PerkinElmer）。

2. 96孔/384孔雙規(guī)格，靈活適配不同通量

該試劑盒提供96孔（100次酶反應(yīng)）和384孔（400次酶反應(yīng)）兩種規(guī)格，用戶可根據(jù)實驗規(guī)模靈活選擇：

96孔規(guī)格：適合常規(guī)實驗、方法開發(fā)及中小規(guī)模抑制劑篩選。

384孔規(guī)格：適合高通量篩選（HTS），單位反應(yīng)成本更低，與自動化移液工作站完美兼容。

3. 內(nèi)置對照（建議自行配置）

雖然試劑盒本身未提供陽性對照抑制劑，但研究人員可使用已知的組蛋白去甲基化酶抑制劑（如CPI-455，針對KDM5家族，但對FBXL10有參考價值）或自行驗證的化合物作為陽性對照。建議在每次實驗中設(shè)置無酶對照（背景信號）和無抑制劑對照（最大信號），以確保數(shù)據(jù)的可靠性。

三、應(yīng)用場景與科研價值

1. FBXL10抑制劑的高通量篩選

FBXL10在DLBCL、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中高表達，其去甲基化酶活性促進腫瘤細胞增殖和遷移。利用該試劑盒，研究人員可以：

在96孔或384孔板中快速篩選數(shù)千個化合物，評估其對FBXL10去甲基化酶活性的抑制效果。

通過劑量-反應(yīng)曲線測定IC50值，比較不同化合物的抑制效力。

篩選FBXL10選擇性抑制劑（與其他KDM家族成員進行正交篩選），為開發(fā)靶向FBXL10的抗腫瘤藥物提供先導(dǎo)化合物。

2. 酶動力學(xué)研究

利用試劑盒中的純化重組酶和生物素化底物，研究人員可以：

通過改變底物濃度，測定FBXL10的米氏常數(shù)（Km）及最大反應(yīng)速率（Vmax）。

分析不同突變體（如與癌癥相關(guān)的FBXL10突變）對酶活性的影響。

研究FBXL10與其他PRC復(fù)合物組分（如RING1B、BMI1）相互作用對酶活性的調(diào)節(jié)。

3. 構(gòu)效關(guān)系（SAR）研究

在藥物化學(xué)優(yōu)化階段，該試劑盒可用于評估系列化合物（如小分子類似物、PROTAC分子）對FBXL10的抑制活性，快速篩選出活性最優(yōu)的候選化合物，指導(dǎo)藥物設(shè)計。

4. 表觀遺傳調(diào)控機制研究

FBXL10不僅催化組蛋白去甲基化，還通過其CXXC結(jié)構(gòu)域結(jié)合非甲基化CpG島，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。利用該試劑盒，研究人員可以定量分析不同細胞狀態(tài)（如分化、應(yīng)激、藥物處理）下FBXL10的酶活性變化，揭示其在表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的功能。

四、操作要點（典型步驟）

1. 準(zhǔn)備試劑：將FBXL10酶、生物素化底物、一抗及檢測緩沖液從-80°C取出，冰上融化。注意避光保存Alpha微球。

2. 配制反應(yīng)混合液：根據(jù)說明書稀釋FBXL10酶至工作濃度。

3. 酶反應(yīng)：在微孔板中加入檢測緩沖液、待測化合物（或抑制劑）、FBXL10酶和生物素化底物，混勻后37°C孵育60-120分鐘。

4. 一抗結(jié)合：加入兔源一抗，室溫孵育30-60分鐘。

5. Alpha微球加入：在避光條件下加入AlphaLISA受體微球和AlphaScreen供體微球（需預(yù)先稀釋至工作濃度），室溫避光孵育30-60分鐘。

6. 讀數(shù)：使用AlphaScreen兼容的熒光微孔板讀數(shù)儀，在680 nm激發(fā)波長下檢測615 nm發(fā)射光強度。

7. 數(shù)據(jù)分析：計算抑制率 =（1 - 樣品信號值 / 無抑制劑對照信號值）× 100%，使用非線性回歸擬合IC50曲線。

五、文獻參考

Iwase S., et al., 2007 Cell 128(6):1077-1088.

Zhao X., et al., 2018 Cell Death Dis. 9(2):46.