解析文章：《Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define putative diagnostic biosignatures for Parkinson’s disease》

作者：Marco Hadisurya¹ , Li Li ² , Kananart Kuwaranancharoen ³ , Xiaofeng Wu ⁴ , Zheng-Chi Lee ^1,5 ,Roy N. Alcalay 6 , Shalini Padmanabhan ⁷ , W. Andy Tao ^{1,2,4,8,9 ?} & Anton Iliuk^{1,2 ?}

鏈接：https://www.nature.com/articles/s43856-023-00294-w

一：背景

帕金森病（Parkinson's Disease, PD）是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，主要由于大腦中的多巴胺能神經(jīng)元死亡導(dǎo)致。PD的早期診斷對于及時(shí)干預(yù)和治療至關(guān)重要，但目前主要依賴于臨床癥狀，缺乏可靠的早期診斷生物標(biāo)志物。本文研究了尿液中細(xì)胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）的蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組，以期發(fā)現(xiàn)潛在的PD早期診斷生物標(biāo)志物。

二：研究目的

本文旨在通過分析來自健康個(gè)體、攜帶LRRK2 G2019S突變但未發(fā)病的非表現(xiàn)型攜帶者（NMC）、散發(fā)性PD患者（iPD）以及攜帶LRRK2 G2019S突變的PD患者（LRRK2PD）的尿液樣本，利用蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，尋找PD的診斷生物標(biāo)志物。

三：方法

樣本收集與處理

樣本來源：來自哥倫比亞大學(xué)歐文醫(yī)學(xué)中心（Columbia University Irving Medical Center, CUIMC）的138份尿液樣本，分為健康對照組（Control）、非表現(xiàn)型攜帶者組（NMC）、散發(fā)性PD組（iPD）和攜帶LRRK2 G2019S突變的PD組（LRRK2PD）。

EV分離：使用EVtrap方法進(jìn)行尿液EV的高效富集。EVtrap基于功能化磁性微珠，對脂質(zhì)雙層膜包裹的EV具有獨(dú)特的親和力。

蛋白質(zhì)提取與消化：通過化學(xué)親和法裂解干燥的EV，提取蛋白質(zhì)并進(jìn)行消化。

LC-MS分析

磷酸肽富集：使用Tymora Analytical Operations品牌的PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit（貨號：707）對磷酸肽進(jìn)行富集。該試劑盒通過高親和力的樹狀分子與磷酸基團(tuán)的相互作用，高效地從復(fù)雜的蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物中分離磷酸肽。

LC-MS檢測：將富集的磷酸肽和直接消化的肽段分別進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析，采用數(shù)據(jù)依賴模式進(jìn)行質(zhì)譜掃描。

生物信息學(xué)分析

數(shù)據(jù)搜索與鑒定：使用Byonic和Sequest搜索引擎對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索，利用Proteome Discoverer軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

定量與統(tǒng)計(jì)分析：通過Label-free定量方法對所有檢測到的蛋白質(zhì)和磷酸蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物。

機(jī)器學(xué)習(xí)與模型訓(xùn)練

特征選擇與模型訓(xùn)練：利用Python和多種機(jī)器學(xué)習(xí)庫（如scikit-learn, XGBoost等）進(jìn)行特征選擇和模型訓(xùn)練，通過隨機(jī)森林分類器進(jìn)行10折交叉驗(yàn)證，評估模型的預(yù)測能力。

四：實(shí)驗(yàn)結(jié)果

蛋白質(zhì)與磷酸蛋白質(zhì)鑒定

蛋白質(zhì)組學(xué)：共鑒定出4476種獨(dú)特蛋白質(zhì)，來自46,240個(gè)肽段。

磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)：共鑒定出2680種獨(dú)特磷酸蛋白質(zhì)，來自10,620個(gè)磷酸肽段。

潛在的生物標(biāo)志物

上調(diào)蛋白質(zhì)與磷酸蛋白質(zhì)：發(fā)現(xiàn)多種在PD組中顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)和磷酸蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)涉及PD的重要通路，如自噬、神經(jīng)元細(xì)胞死亡、神經(jīng)炎癥和淀粉樣纖維形成。

機(jī)器學(xué)習(xí)選定的頂級生物標(biāo)志物：通過機(jī)器學(xué)習(xí)和交叉驗(yàn)證，選定了六個(gè)頂級生物標(biāo)志物（PCSK1N, HNRNPA1, pPLA2G4A, pLTB4R, pPRR15, pPPFIA1），這些標(biāo)志物在PD患者中顯著上調(diào)，具有較高的診斷準(zhǔn)確性（AUC=94.3%）。

PolyMAC試劑盒的作用與價(jià)值

高效富集磷酸肽：PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit通過其獨(dú)特的樹狀分子結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了對磷酸肽的高效選擇性富集，顯著提高了磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)分析的靈敏度和深度。

提高數(shù)據(jù)質(zhì)量：磷酸化修飾直接反映了細(xì)胞的生理狀態(tài)，特別是在神經(jīng)退行性疾病中。PolyMAC試劑盒的應(yīng)用使得尿液EV中的磷酸蛋白質(zhì)組能夠被全面、準(zhǔn)確地解析，為PD早期診斷生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供了有力支持。

促進(jìn)非侵入性診斷技術(shù)的發(fā)展：尿液作為易于獲取的非侵入性生物樣本，結(jié)合PolyMAC試劑盒的高效磷酸肽富集技術(shù)，為PD等疾病的早期診斷提供了新的可能性。

五：結(jié)論

本文通過尿液EV的蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)，成功發(fā)現(xiàn)了多個(gè)潛在的PD早期診斷生物標(biāo)志物。

PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit在磷酸肽的高效富集方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，提高了磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的覆蓋度和準(zhǔn)確性，為PD等復(fù)雜疾病的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)提供了有力的技術(shù)支持。這些發(fā)現(xiàn)不僅有助于PD的早期診斷，還可能為疾病機(jī)制的研究和新型治療藥物的開發(fā)提供重要線索。

六：未來展望

未來的研究將進(jìn)一步驗(yàn)證這些潛在生物標(biāo)志物的臨床價(jià)值，并通過更大規(guī)模的隊(duì)列研究來評估其診斷效能。此外，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，尿液EV磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)有望在更多疾病的早期診斷中發(fā)揮重要作用，成為精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域的重要工具。

Tymora品牌PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit

貨號：707-96 富集磷酸化蛋白

PolyMAC 基于金屬離子功能化的可溶性納米聚合物，在均勻的水環(huán)境中螯合磷酸肽。與目前基于固相微米和納米顆粒的策略相比，PolyMAC 表現(xiàn)出出色的重現(xiàn)性、卓越的選擇性、快速的螯合時(shí)間以及從復(fù)雜混合物中高的磷酸肽回收率。

從這段描述中可以看出 PolyMAC 的幾個(gè)顯著優(yōu)勢：

一、出色的重現(xiàn)性

意味著在不同的實(shí)驗(yàn)條件下或者由不同的實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行操作時(shí)，都能得到較為一致的結(jié)果。這對于科學(xué)研究的可靠性和可重復(fù)性至關(guān)重要，能夠減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高研究結(jié)果的可信度。

二、卓越的選擇性

可以更精準(zhǔn)地從復(fù)雜混合物中識別并結(jié)合磷酸肽，減少其他非目標(biāo)物質(zhì)的干擾。在分析復(fù)雜生物樣本時(shí)，高選擇性能夠確保對特定目標(biāo)分子的準(zhǔn)確檢測和研究。

三、快速的螯合時(shí)間

能夠提高實(shí)驗(yàn)效率，縮短研究周期。在現(xiàn)代科學(xué)研究中，時(shí)間往往是一個(gè)關(guān)鍵因素，快速的反應(yīng)時(shí)間可以使研究人員更快地獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加速研究進(jìn)程。

四、高磷酸肽回收率

從復(fù)雜混合物中有效地回收磷酸肽意味著可以更充分地利用樣本，提高分析的靈敏度和準(zhǔn)確性。對于低豐度的磷酸肽，高回收率尤為重要，可以確保對這些關(guān)鍵生物分子的檢測和研究。

綜上所述，PolyMAC 這種基于可溶性納米聚合物的技術(shù)在磷酸肽的分析和研究中具有很大的潛力，有望為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供更高效、更可靠的方法。