熒光三NTA化合物為聚組氨酸標(biāo)記蛋白的位點(diǎn)特異性和穩(wěn)定的非共價(jià)熒光標(biāo)記提供了一種有效的方法。與傳統(tǒng)單NTA的瞬時(shí)結(jié)合相比，三NTA共軛熒光團(tuán)的多價(jià)相互作用與聚組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)形成了更穩(wěn)定的復(fù)合物。tris-NTA化合物對累積組氨酸的高選擇性使其能夠選擇性標(biāo)記細(xì)胞裂解物和活細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)。熒光三NTA偶聯(lián)物可用于分析溶液和表面上的三元蛋白質(zhì)復(fù)合物。過渡金屬離子（如鎳離子）介導(dǎo)的聚組氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)與熒光tris-NTA偶聯(lián)物的絡(luò)合為實(shí)時(shí)檢測和監(jiān)測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用提供了靈敏的報(bào)告。據(jù)報(bào)道，這種OG488 tris-NTA化合物是一種靈敏的熒光探針，用于檢測細(xì)胞、溶液和固體表面中的聚組氨酸標(biāo)記蛋白。

艾美捷HIS Lite OG488-Tris NTA-Ni復(fù)合物：

貨號 AAT-12615

單位大小：100微克

目錄編號：12615

分子量：1838.08

溶劑：水

校正因子（260納米）：0.31

校正因子（280納米）：0.12

消光系數(shù)（cm -1 M -1）：76000

激發(fā)（納米）：498

發(fā)射（納米）：526

預(yù)期用途：僅供研究使用（RUO）

儲存：冷凍（<-15°C）；盡量減少光照

激發(fā)：藍(lán)色激光

發(fā)射：長路徑綠色濾光片（SYBR濾光片）

庫存溶液的準(zhǔn)備：除非另有說明，所有未使用的庫存溶液應(yīng)在制備后分成單次使用的小份，并儲存在-20°C。避免反復(fù)凍融。

HIS Lite? OG488-Tris NTA-Ni復(fù)合物庫存溶液：通過添加適量的去離子水（ddH2O）制備5至10毫摩爾的庫存溶液。

注意：將任何未使用的庫存溶液儲存在-20°C。避免反復(fù)凍融，并盡量減少光照。

工作溶液的準(zhǔn)備：

HIS Lite? OG488-Tris NTA-Ni復(fù)合物工作溶液

在PBS中制備1至10微米濃度的HIS Lite? OG488-Tris NTA-Ni復(fù)合物工作溶液。

注意：確保有足夠的工作溶液完全浸沒凝膠。使用后，丟棄工作溶液，不要重復(fù)使用。

樣品實(shí)驗(yàn)協(xié)議：

以下協(xié)議僅作為指導(dǎo)，并可能需要優(yōu)化以更好地適應(yīng)您的具體實(shí)驗(yàn)需求。

跑后凝膠染色協(xié)議：

根據(jù)您的標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議運(yùn)行凝膠。

將凝膠放置在合適的容器中。將凝膠固定在固定液中60分鐘。注意：40%乙醇+10%醋酸可以作為固定液。

用超純水兩次洗滌凝膠。

將凝膠在HIS Lite? OG488-Tris NTA-Ni復(fù)合物工作溶液中孵育60分鐘。

注意：確保凝膠完全浸沒在工作溶液中。

移除工作溶液，并用PBS兩次洗滌凝膠。

立即進(jìn)行凝膠成像。

體外復(fù)合物形成：

將帶有His標(biāo)簽的蛋白溶液與HIS Lite? OG488-Tris NTA-Ni復(fù)合物工作溶液按適當(dāng)濃度混合。

注意：必須對HIS Lite? OG488-Tris NTA-Ni復(fù)合物與帶有His標(biāo)簽的蛋白混合物進(jìn)行優(yōu)化，以獲得更好的標(biāo)記。

注意：1至10微米的HIS Lite? OG488-Tris NTA-Ni復(fù)合物可以用作起始濃度。

注意：反應(yīng)可以在含有50 mM HEPES/KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM β-巰基乙醇，5%甘油的緩沖液中進(jìn)行，或者在您選擇的緩沖液中進(jìn)行。

混合物可以在室溫下孵育30分鐘，或在4°C下孵育。

注意：必須對孵育時(shí)間和條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得更好的標(biāo)記。

然后，混合物可以進(jìn)行柱純化或任何其他下游處理。