鈣離子熒光探針Cal-520，AM提供了一種穩(wěn)健的均相熒光檢測工具，用于檢測細胞內鈣動員。Cal-520 AM是一種新型的熒光發(fā)生型鈣敏感染料，與現(xiàn)有的綠色鈣指示劑（如Fluo-3 AM和Fluo-4 AM）相比，具有顯著提高的信噪比和細胞內保留能力。表達感興趣GPCR或鈣通道的細胞，這些通道通過鈣信號傳導，可以預加載Cal-520 AM，它能夠穿過細胞膜。一旦進入細胞內，Cal-520? AM的親脂性阻斷基團被酯酶裂解，產(chǎn)生一種帶負電荷的熒光染料，留在細胞內。其熒光在結合鈣時大大增強。當細胞被激動劑刺激時，受體會信號釋放細胞內鈣，這顯著增加了Cal-520的熒光。其長波長、高靈敏度和>100倍熒光增強的特性，使Cal-520 AM成為測量細胞鈣的理想指示劑。高信噪比和更好的細胞內保留能力使Cal-520鈣測定成為評估GPCR和鈣通道靶點以及篩選它們的激動劑和拮抗劑的有力工具。

艾美捷鈣離子熒光探針Cal-520，AM（AAT-21130）：

制備母液：

除非另有說明，所有未使用的母液應在制備后分裝成單次使用的小份，并在-20°C下儲存。避免反復凍融。

Cal-520 AM母液

在高質量的無水DMSO中制備2到5 mM的Cal-520 AM母液。

注意：在DMSO中重組時，Cal-520 AM是一種清澈無色的溶液。

制備工作溶液：

Cal-520 AM工作溶液

在實驗當天，將Cal-520 AM溶解在DMSO中，或將指示劑母液的小份解凍至室溫。

在您選擇的緩沖液中（例如，Hanks和Hepes緩沖液）用0.04%的Pluronic F-127制備2到20 ?M的Cal-520 AM工作溶液。對于大多數(shù)細胞系，建議使用最終濃度為4-5 μM的Cal-520 AM。細胞加載所需的指示劑的確切濃度必須通過實驗確定。

注意：非離子洗滌劑Pluronic F-127有時被用來增加Cal-520 AM的水溶性。可以從AAT Bioquest購買各種Pluronic F-127溶液。

注意：如果您的細胞含有有機陰離子轉運體，可能會向染料工作溶液中添加probenecid（1-2 mM）（最終在孔中的濃度將是0.5-1 mM），以減少去酯化指示劑的泄漏。可以從AAT Bioquest購買各種ReadiUse? Probenecid產(chǎn)品，包括水溶性、鈉鹽和穩(wěn)定溶液。

樣本實驗協(xié)議：

以下是我們推薦的將AM酯加載到活細胞中的協(xié)議。此協(xié)議僅提供指導方針，應根據(jù)您的具體需求進行修改。

在生長介質中準備細胞過夜。

第二天，向您的細胞板中添加1X Cal-520 AM工作溶液。

注意：如果您的化合物與血清發(fā)生干擾，在染料加載前用新鮮的HHBS緩沖液替換生長介質。

將染料加載的板在37°C的細胞培養(yǎng)箱中孵育1到2小時。

注意：孵育染料超過2小時可以提高某些細胞系的信號強度。

用HHBS或您選擇的緩沖液（如果適用，含有陰離子轉運體抑制劑，如1 mM probenecid）替換染料工作溶液，以去除任何多余的探針。

根據(jù)需要添加刺激劑，并同時使用帶有FITC濾光片組的熒光顯微鏡或含有可編程液體處理系統(tǒng)的熒光板讀取器（如FDSS、FLIPR或FlexStation）測量熒光，Ex/Em = 490/525 nm截止515 nm。

圖1. 在相同條件下，ATP刺激的CHO-K1細胞內源性P2Y受體的鈣反應，分別用Cal-520? AM（紅色曲線）或Fluo-4 AM（藍色曲線）處理，并且在左側有probenecid，右側則沒有。CHO-K1細胞在Costar黑色壁/透明底的96孔板中以每孔100 ?L、50,000個細胞的密度過夜培養(yǎng)。向細胞中加入100 ?L的5 ?M Fluo-4 AM或Cal-520? AM（在HHBS中，含或不含probenecid），并在37°C下孵育1小時。然后使用FlexStation添加ATP（50 μL/孔），以達到最終指示的濃度。

鈣離子熒光探針Cal-520，AM文獻參考：

Measurement and simulation of myoplasmic calcium transients in mouse slow-twitch muscle fibres

Authors: Hollingworth S, Kim MM, Baylor SM.

Journal: J Physiol (2012): 575

Mononucleated and binucleated cardiomyocytes in left atrium and pulmonary vein have different electrical activity and calcium dynamics

Authors: Huang CF, Chen YC, Yeh HI, Chen SA.

Journal: Prog Biophys Mol Biol (2012): 64

Changes in serum levels of HBV DNA and alanine aminotransferase determine risk for hepatocellular carcinoma

Authors: Chen CF, Lee WC, Yang HI, Chang HC, Jen CL, Iloeje UH, Su J, Hsiao CK, Wang LY, You SL, Lu SN, Chen CJ.

Journal: Gastroenterology (2011): 1240

A near-infrared fluorescent calcium probe: a new tool for intracellular multicolour Ca2+ imaging

Authors: Matsui A, Umezawa K, Shindo Y, Fujii T, Citterio D, Oka K, Suzuki K.

Journal: Chem Commun (Camb) (2011): 10407

Application of fluorescent indicators to analyse intracellular calcium and morphology in filamentous fungi

Authors: Nair R, Raina S, Keshavarz T, Kerrigan MJ.

Journal: Fungal Biol (2011): 326