Phalloidin偶聯(lián)物以高親和力染色固定和滲透細(xì)胞中的F-actin。

Phalloidin是一種從毒死帽蘑菇鵝膏菌中分離出來的雙環(huán)七肽。其對絲狀肌動蛋白（F-actin）與單體G-肌動蛋白之間的凹槽的高結(jié)合親和力被廣泛用于在組織切片、細(xì)胞培養(yǎng)或無細(xì)胞制劑中可視化和定量F-actin。與肌動蛋白特異性抗體相比，鬼筆環(huán)肽的非特異性結(jié)合可以忽略不計(jì)，從而在細(xì)胞成像過程中提供最小的背景和高對比度。一旦與F-actin結(jié)合，鬼筆環(huán)肽就會將單體和細(xì)絲的平衡向細(xì)絲側(cè)移動，并抑制ATP水解。這種相互作用通過防止亞基解離來穩(wěn)定肌動蛋白絲，并通過降低臨界濃度來促進(jìn)肌動蛋白聚合。

當(dāng)與熒光染料結(jié)合時(shí)，鬼筆環(huán)肽可以以納摩爾濃度用于標(biāo)記和可視化固定和滲透細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)和無細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的F-actin，以及甲醛固定和滲透組織切片。Phalloidin偶聯(lián)物對所有類型和大小的肌動蛋白絲表現(xiàn)出相似的親和力，在肌肉和非肌肉細(xì)胞中以1:1的化學(xué)計(jì)量比（phallotoxin:肌動蛋白）結(jié)合。與抗體相比，鬼筆環(huán)肽衍生物很小（<2kDa），與鬼筆環(huán)蛋白結(jié)合的細(xì)絲不會阻礙細(xì)絲的功能特性。小尺寸也允許更密集的F-actin標(biāo)記，在更高分辨率下成像時(shí)產(chǎn)生更詳細(xì)的染色。此外，由于肌動蛋白在進(jìn)化上是保守的，鬼筆環(huán)肽衍生物的結(jié)合特性可用于染色各種動物和植物細(xì)胞。

艾美捷鬼筆環(huán)肽-iFluor 488偶聯(lián)物：

貨號 AAT-23115

偶聯(lián)物：iFluor 488

單位大小：300次測試

分子量：~1400

溶劑：DMSO

預(yù)期用途 僅供研究使用（RUO）

儲存：冷凍（<-15°C）；盡量減少光照

校正因子（260納米）：0.21

校正因子（280納米）：0.11

消光系數(shù)（cm -1 M -1）：75000

激發(fā)（納米）：491

發(fā)射（納米）：516

量子產(chǎn)率：0.9

協(xié)議概要：

在微孔板孔中準(zhǔn)備樣品

從板中的樣品中移除液體

加入Phalloidin-iFluor? 488偶聯(lián)溶液（每孔100 μL）

在室溫下對細(xì)胞進(jìn)行20至90分鐘的染色

洗滌細(xì)胞

在顯微鏡下使用FITC濾光片檢查樣本

重要事項(xiàng)     在打開前將瓶加熱至室溫并短暫離心。

儲存和處理?xiàng)l件：

如果儲存在-20°C，溶液至少穩(wěn)定6個月。保護(hù)熒光偶聯(lián)物不受光線影響，并避免凍融循環(huán)。

注意     Phalloidin有毒，盡管一瓶中的毒素量可能只對蚊子致命（Phalloidin的LD50 = 2 mg/kg），應(yīng)小心處理。

工作溶液的準(zhǔn)備：

Phalloidin-iFluor? 488偶聯(lián)工作溶液

將1 μL的Phalloidin-iFluor? 488偶聯(lián)溶液加入到含1% BSA的PBS中。

注意     Phalloidin偶聯(lián)物的庫存溶液應(yīng)分裝并儲存在-20°C，避免光線照射。

注意     不同細(xì)胞類型可能染色不同。應(yīng)相應(yīng)準(zhǔn)備Phalloidin偶聯(lián)工作溶液的濃度。

樣品實(shí)驗(yàn)協(xié)議：

染色細(xì)胞

進(jìn)行甲醛固定。在室溫下，將細(xì)胞與PBS中的3.0-4.0%甲醛一起孵育10-30分鐘。

注意：避免使用任何含有甲醇的固定劑，因?yàn)榧状伎赡軙诠潭ㄟ^程中破壞肌動蛋白。首選的固定劑是無甲醇的甲醛。

用PBS沖洗固定的細(xì)胞2-3次。

可選：將0.1% Triton X-100加入PBS中，用于固定細(xì)胞3至5分鐘以增加通透性。用PBS沖洗細(xì)胞2-3次。

在固定的細(xì)胞中加入100 μL/孔（96孔板）的Phalloidin-iFluor? 488偶聯(lián)工作溶液，并在室溫下對細(xì)胞進(jìn)行20至90分鐘的染色。

在將細(xì)胞板封蓋和在顯微鏡下使用FITC濾光片組進(jìn)行成像之前，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞2至3次以去除多余的Phalloidin偶聯(lián)物。

圖：使用帶有FITC濾光片組的熒光顯微鏡（綠色）對用Phalloidin iFluor?488共軛物染色的HeLa細(xì)胞的熒光圖像。將細(xì)胞固定在4%甲醛中，用線粒體染料MitoLite?Red FX600（Cat#2677，紅色）和Nuclear Blue?DCS1（Cat#17548，藍(lán)色）共標(biāo)記。