AAT Bioquest的iFluor 染料經(jīng)過優(yōu)化，可用于標(biāo)記蛋白質(zhì)，特別是抗體。這些染料明亮、耐光，對蛋白質(zhì)的淬滅作用最小。它們可以被熒光儀器的主要激光線（例如350、405、488、555和633nm）很好地激發(fā)。iFluor?647系列的光譜特性與Cy5 基本相同。與Cy5?探針相比，iFluor 647試劑具有更強的熒光和更高的光穩(wěn)定性。它們的熒光在pH 3至11范圍內(nèi)與pH無關(guān)。這些光譜特性使這種新的染料家族成為Cy5和Alexa Fluor 647的絕佳替代品（Cy5與Alexa Fluor是GE Health Care和Invitrogen的商標(biāo)）。iFluor?647 SE相當(dāng)穩(wěn)定，與蛋白質(zhì)氨基具有良好的反應(yīng)性和選擇性。

艾美捷iFluor 647琥珀酰亞胺酯：

貨號：AAT-71560

單位大小：1 毫克

分子量：1274.66

溶劑：DMSO（二甲基亞砜）

校正因子（260 納米）：0.03

校正因子（280 納米）：0.03

校正因子（656 納米）：0.0793

消光系數(shù)（cm -1 M -1）：250000

激發(fā)（納米）：656

發(fā)射（納米）：670

量子產(chǎn)率：0.25

H-短語：H303, H313, H333

危險符號：XN

預(yù)期用途：僅限研究使用（RUO）

R-短語：R20, R21, R22

儲存：冷凍（< -15 °C）；盡量減少光照暴露

庫存溶液的準備：除非另有說明，所有未使用的庫存溶液應(yīng)在制備后分成單次使用的小份，并儲存在 -20 °C。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

蛋白質(zhì)庫存溶液（溶液 A）：

將 100 微升的反應(yīng)緩沖液（例如，1 M 碳酸鈉溶液或 pH 約 9.0 的 1 M 磷酸緩沖液）與 900 微升的目標(biāo)蛋白質(zhì)溶液（例如，抗體，蛋白質(zhì)濃度盡可能大于 2 mg/mL）混合，得到 1 毫升蛋白質(zhì)標(biāo)記庫存溶液。

注意：蛋白質(zhì)溶液（溶液 A）的 pH 值應(yīng)為 8.5 ± 0.5。如果蛋白質(zhì)溶液的 pH 值低于 8.0，請使用 1 M 碳酸氫鈉溶液或 1 M pH 9.0 磷酸緩沖液調(diào)整 pH 值至 8.0-9.0 范圍內(nèi)。

注意：蛋白質(zhì)應(yīng)溶解在 1X 磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）中，pH 7.2-7.4。如果蛋白質(zhì)溶解在 Tris 或甘氨酸緩沖液中，必須對其進行透析，以對抗 1X PBS，pH 7.2-7.4，以去除廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（如硫酸銨和醋酸銨）。

注意：不純的抗體或用牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩(wěn)定的抗體將不會被很好地標(biāo)記。亞硝酸鈉或硫柳汞的存在也可能干擾偶聯(lián)反應(yīng)。亞硝酸鈉或硫柳汞可以通過透析或旋轉(zhuǎn)柱來去除，以獲得最佳的標(biāo)記結(jié)果。

注意：如果蛋白質(zhì)濃度低于 2 mg/mL，偶聯(lián)效率將顯著降低。為了獲得最佳的標(biāo)記效率，建議最終蛋白質(zhì)濃度范圍在 2-10 mg/mL 之間。

iFluor? 647 SE 庫存溶液（溶液 B）：

向 iFluor? 647 SE 的瓶中加入無水 DMSO，制成 10 mM 庫存溶液。通過移液或渦旋混合均勻。

注意：在開始偶聯(lián)之前準備染料庫存溶液（溶液 B）。請立即使用。染料庫存溶液的長期儲存可能會降低染料活性。溶液 B 可以在避光和防潮的情況下在冷凍庫中儲存兩周。避免凍融循環(huán)。

樣品實驗協(xié)議：

這個標(biāo)記協(xié)議是為山羊抗小鼠 IgG 與 iFluor? 647 SE 的偶聯(lián)而開發(fā)的。您可能需要根據(jù)您的特定蛋白質(zhì)進行進一步優(yōu)化。

注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的性質(zhì)。過度標(biāo)記蛋白質(zhì)可能會對其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響，而染料/蛋白質(zhì)比例過低的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物則靈敏度降低。

進行偶聯(lián)反應(yīng)：

使用 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白質(zhì)）的摩爾比例作為起點：將 5 微升的染料庫存溶液（溶液 B，假設(shè)染料庫存溶液為 10 mM）加入蛋白質(zhì)溶液（95 微升的溶液 A）的瓶中，并有效搖動。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為 10 mg/mL，蛋白質(zhì)分子量約為 200KD，蛋白質(zhì)的濃度約為 0.05 mM。

注意：我們建議使用 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白質(zhì)）的摩爾比例。如果太低或太高，請分別確定 5:1、15:1 和 20:1 的最佳染料/蛋白質(zhì)比例。

繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動反應(yīng)混合物 30-60 分鐘。

純化偶聯(lián)物：

以下是一個使用 Sephadex G-25 柱純化染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的示例協(xié)議。

根據(jù)制造商的說明準備 Sephadex G-25 柱。

將反應(yīng)混合物（來自“運行偶聯(lián)反應(yīng)”）加載到 Sephadex G-25 柱的頂部。

當(dāng)樣品剛剛低于頂部樹脂表面時，立即添加 PBS（pH 7.2-7.4）。

添加更多的 PBS（pH 7.2-7.4）以完成所需的樣品柱純化。合并包含所需染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的分數(shù)。

注意：如果立即使用，染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋，并分裝多次使用。

注意：對于長期儲存，染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

表征所需的染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物

取代度（DOS）是表征染料標(biāo)記蛋白質(zhì)的最重要因素。較低 DOS 的蛋白質(zhì)通常具有較弱的熒光強度，但較高 DOS 的蛋白質(zhì)也傾向于降低熒光。對于大多數(shù)抗體，推薦的最優(yōu) DOS 在 2 到 10 之間，具體取決于染料和蛋白質(zhì)的性質(zhì)。為了有效標(biāo)記，應(yīng)控制取代度，使每摩爾抗體有 4-6 摩爾的 iFluor? 647 SE。以下步驟用于確定 iFluor? 647 SE 標(biāo)記蛋白質(zhì)的 DOS。

測量吸收：

為了測量染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的吸收光譜，建議保持樣品濃度在 1-10 ?M 范圍內(nèi)，具體取決于染料的消光系數(shù)。

讀取 OD（吸光度）在 280 納米和染料最大吸收（λmax = 656 納米，對于 iFluor? 647 染料）

對于大多數(shù)分光光度計，需要將樣品（來自柱分數(shù)）用去離子水稀釋，以便 OD 值在 0.1 到 0.9 的范圍內(nèi)。280 納米的 O.D.（吸光度）是蛋白質(zhì)的最大吸收，而 656 納米是 iFluor? 647 SE 的最大吸收。為了獲得準確的 DOS，請確保偶聯(lián)物中不含未偶聯(lián)的染料。

圖：HeLa細胞用小鼠抗微管蛋白染色，然后用iFluorTM 647山羊抗小鼠IgG（H+L）（紅色）染色；細胞核用DAPI（藍色）染色。