隨著基因治療技術(shù)的快速發(fā)展，眼部基因治療成為治療遺傳性視網(wǎng)膜疾病的一種新興手段。特別是針對Leber先天性黑矇（Leber Congenital Amaurosis, LCA）等疾病的基因治療已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展。腺相關(guān)病毒（AAV）因其高效性和相對安全性，被廣泛用作基因治療的載體。然而，AAV載體及其轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物引發(fā)的宿主免疫反應(yīng)可能會限制治療效果。“Host Immune Responses after Suprachoroidal Delivery of AAV8 in Nonhuman Primate Eyes”聚焦于經(jīng)脈絡(luò)膜上腔遞送AAV8載體后的宿主免疫反應(yīng)，特別是其對非人靈長類動物（NHP）眼中的綠色熒光蛋白（GFP）轉(zhuǎn)基因表達(dá)的影響。

方法

1. AAV8載體生產(chǎn)及眼內(nèi)注射：研究團(tuán)隊使用了攜帶增強(qiáng)型GFP的AAV8載體，并進(jìn)行包裝和純化。在動物鎮(zhèn)靜后，使用30號微針將AAV8注射到NHP的脈絡(luò)膜上腔或玻璃體內(nèi)。為了比較不同注射途徑對免疫反應(yīng)的影響，研究設(shè)計了三種注射方案：雙側(cè)脈絡(luò)膜上腔注射、脈絡(luò)膜上腔與視網(wǎng)膜下聯(lián)合注射、以及雙側(cè)玻璃體內(nèi)注射。

2. 眼部成像：所有動物在注射前后均進(jìn)行了掃描激光檢眼鏡（SLO）和光譜域光學(xué)相干斷層掃描（SD-OCT）成像，以監(jiān)測轉(zhuǎn)基因表達(dá)情況和眼部炎癥變化。成像數(shù)據(jù)通過Spectralis HRA+OCT設(shè)備捕獲，并分析視網(wǎng)膜形態(tài)和熒光表達(dá)情況。

3. 免疫反應(yīng)評估：體液免疫反應(yīng)：通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中的抗AAV8和抗GFP抗體水平。特別是，研究使用了PROGEN品牌的AAV8 titration ELISA kit（貨號：PRAAV8），該試劑盒專門設(shè)計用于AAV8滴度的定量檢測，確保了抗體檢測的準(zhǔn)確性和特異性。該方法通過夾心法檢測血清中針對AAV8衣殼的抗體，為評估AAV8載體引發(fā)的體液免疫反應(yīng)提供了有力工具；細(xì)胞免疫反應(yīng)：通過酶聯(lián)免疫斑點試驗（ELISpot）檢測外周血單核細(xì)胞（PBMCs）和脾細(xì)胞中的干擾素γ（IFN-γ）分泌細(xì)胞，以評估T細(xì)胞對AAV8衣殼和GFP的反應(yīng)；生物分布分析：使用定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測肝臟、脾臟和腎臟中的GFP轉(zhuǎn)基因序列，以評估AAV8載體的系統(tǒng)生物分布情況；免疫組化分析：通過免疫組化技術(shù)檢測眼部組織中GFP表達(dá)及免疫細(xì)胞浸潤情況，進(jìn)一步確認(rèn)局部免疫反應(yīng)。

PROGEN品牌的AAV8 titration ELISA kit

實驗結(jié)果

1. 轉(zhuǎn)基因表達(dá)與眼部炎癥：脈絡(luò)膜上腔注射AAV8后，在1個月時觀察到廣泛的GFP表達(dá)，但隨著時間的推移，GFP表達(dá)逐漸局限于鞏膜成纖維細(xì)胞。高劑量脈絡(luò)膜上腔注射后，部分動物出現(xiàn)了輕度前葡萄膜炎和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎，經(jīng)系統(tǒng)糖皮質(zhì)激素治療后得到緩解。相比之下，視網(wǎng)膜下注射和玻璃體內(nèi)注射的炎癥反應(yīng)較輕。

2. 體液免疫反應(yīng)：ELISA結(jié)果顯示，脈絡(luò)膜上腔注射AAV8后，動物產(chǎn)生了針對GFP的顯著抗體反應(yīng)，但針對AAV8衣殼的抗體反應(yīng)較弱。相比之下，玻璃體內(nèi)注射AAV8引發(fā)了更強(qiáng)的針對AAV8衣殼的體液免疫反應(yīng)。這表明脈絡(luò)膜上腔注射可能減少了AAV8衣殼向循環(huán)系統(tǒng)的暴露，從而降低了體液免疫反應(yīng)。

3. 細(xì)胞免疫反應(yīng)：通過ELISpot和流式細(xì)胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)脈絡(luò)膜上腔注射AAV8后，PBMCs和脾細(xì)胞對GFP產(chǎn)生了強(qiáng)烈的T細(xì)胞反應(yīng)，而對AAV8衣殼的反應(yīng)較弱。這進(jìn)一步支持了脈絡(luò)膜上腔注射可能減少了針對AAV8衣殼的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

4. 生物分布：qPCR分析顯示，脈絡(luò)膜上腔注射后AAV8在脾臟和肝臟中的分布低于玻璃體內(nèi)注射，這解釋了脈絡(luò)膜上腔注射引發(fā)的體液免疫反應(yīng)較弱的原因。

本研究表明，脈絡(luò)膜上腔注射AAV8載體在NHP眼中能夠引發(fā)廣泛的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，但引發(fā)的宿主免疫反應(yīng)相對較弱。特別是對AAV8衣殼的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)顯著低于玻璃體內(nèi)注射，這可能與脈絡(luò)膜上腔注射減少了AAV8向循環(huán)系統(tǒng)的暴露有關(guān)。盡管如此，脈絡(luò)膜上腔注射仍引發(fā)了針對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物GFP的顯著免疫反應(yīng)，提示在未來的基因治療中需要進(jìn)一步優(yōu)化載體和轉(zhuǎn)基因設(shè)計，以減少免疫反應(yīng)對治療效果的影響。PROGEN品牌的AAV8 titration ELISA kit（貨號：PRAAV8）在本研究中發(fā)揮了重要作用。該試劑盒通過夾心法精確檢測血清中針對AAV8衣殼的抗體水平，為評估AAV8載體引發(fā)的體液免疫反應(yīng)提供了可靠的方法。其準(zhǔn)確性和特異性確保了研究結(jié)果的可靠性，為深入理解AAV8載體在眼內(nèi)遞送后的免疫反應(yīng)機(jī)制提供了有力支持。該試劑盒的應(yīng)用不僅限于本研究，還可廣泛應(yīng)用于AAV基因治療相關(guān)的基礎(chǔ)研究和臨床試驗中，為評估和優(yōu)化基因治療效果提供重要參考。

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