C-反應蛋白（CRP）ELISA是一種測定CRP的定量免疫測定法，在人血清中。僅供研究使用。不用于診斷或治療程序。

艾美捷C-反應蛋白（hsCRP）ELISA（ALP-11-CRPHU-E01）檢測原理：

CRP ELISA是一種兩步捕獲或“夾心”類型的免疫測定。該檢測使用兩種高度特異性的單克隆抗體：一種特異性針對CRP的單克隆抗體固定在微孔板上，另一種針對CRP不同表位的單克隆抗體與辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合（HRP結(jié)合物）。在第一次孵育步驟中，樣本、校準品和對照品中存在的CRP被固定在微孔板上的抗體所結(jié)合。通過洗滌步驟去除多余的和未結(jié)合的物質(zhì)。

在第二次孵育步驟中，添加HRP結(jié)合的抗體（HRP結(jié)合物），它特異性地結(jié)合到任何固定的CRP上，形成夾心復合物。通過洗滌步驟去除未結(jié)合的HRP結(jié)合物。接下來，添加TMB底物（酶底物）并與HRP反應形成藍色產(chǎn)物，其顏色的深淺與樣本中存在的CRP量成正比。通過添加停止溶液來終止酶促反應，將顏色從藍色變?yōu)辄S色。在450 nm處使用微孔板讀取器測量吸光度。使用一組校準品繪制校準曲線，從而可以直接讀取樣本和對照品中CRP的含量。

C-反應蛋白（hsCRP）ELISA分析程序：

注：所有樣品在測試前必須進行預處理（見樣品預處理和儲存第節(jié)）。不要對校準器和試劑盒控件進行預處理，因為它們是現(xiàn)成的。所有試劑和樣品在使用前必須達到室溫。校準器、控制裝置和樣品應一式兩份進行化驗。一旦程序開始，所有步驟都應該不間斷地完成。

1. 所有試劑盒組分達到室溫后，輕輕倒置混合。

2. 準備1倍工作HRP結(jié)合物和1倍工作洗滌緩沖液。

3. 準備待測的血清樣本（見樣本預處理及儲存部分）。

4. 從微孔板中取出所需數(shù)量的條帶，并組裝成板架。將未使用的條帶放回帶有干燥劑的袋子中，重新密封，并存放在冰箱中。

5. 將每個校準品、對照品和預處理樣本的20 ?L分別加入指定孔中，并進行復孔操作。

6. 向每個孔中加入200 μL的檢測緩沖液（推薦使用多通道移液器）。

7. 在室溫下，放在微孔板搖床上孵育30分鐘（往復式搖床約180次/分鐘或軌道式搖床約600轉(zhuǎn)/分鐘）。

8. 使用自動微孔板洗滌器（首選）或按以下方法手動洗滌微孔板。

自動：使用1倍工作洗滌緩沖液（每孔300 ?L）進行3周期洗滌（3次300 ?L）。一個周期包括吸去所有孔中的液體，然后每個孔中注入300 ?L的1倍工作洗滌緩沖液。在最后一次洗滌周期后，吸去所有孔中的液體，然后將板子牢固地拍打在吸水紙上以去除殘留液體。

手動：使用1倍工作洗滌緩沖液（每孔300 ?L）進行3周期洗滌（3次300 ?L）。一個周期包括通過將孔中的內(nèi)容迅速倒入廢液容器來吸去所有孔中的液體，然后使用多通道移液器向每個孔中注入300 ?L的1倍工作洗滌緩沖液。在最后一次洗滌周期后，通過將孔中的內(nèi)容迅速倒入廢液容器來吸去所有孔中的液體。將板子牢固地拍打在吸水紙上以去除殘留液體。

9. 向每個孔中加入100 ?L的1倍工作HRP結(jié)合物（推薦使用多通道移液器）。

10. 在室溫下，放在微孔板搖床上孵育15分鐘（往復式搖床約180次/分鐘或軌道式搖床約600轉(zhuǎn)/分鐘）。

11. 按照步驟8中的方法再次洗滌微孔板孔。

12. 向每個孔中加入100 ?L的TMB底物（推薦使用多通道移液器）。

13. 在室溫下，放在微孔板搖床上孵育10-15分鐘（往復式搖床約180次/分鐘或軌道式搖床約600轉(zhuǎn)/分鐘）。

14. 按照加入TMB底物的相同順序和時間間隔，向每個孔中加入50 ?L的停止溶液（推薦使用多通道移液器）。輕輕拍打微孔板架以混合孔中的內(nèi)容。

15. 在加入停止溶液后20分鐘內(nèi)，使用設定為450 nm的吸光度微孔板讀取器測量光密度（吸光度）。

C-反應蛋白（hsCRP）ELISA典型校準器曲線：

僅示例曲線。不用于計算結(jié)果