用于定量測(cè)量Vaspin的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）是基于通過遺傳免疫接種兔子（cDNA Vaspin SC306941）產(chǎn)生的多克隆兔抗血清。Vaspin，也稱為SerpinA12，是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，由395個(gè)氨基酸組成，形成3個(gè)β-折疊和9個(gè)α-螺旋。Vaspin的分子量約為45.2 kDa。它不形成多聚體聚集體或分子內(nèi)二硫鍵，并且已知在人血清中沒有結(jié)合蛋白。Vaspin基因不僅在皮下和內(nèi)臟脂肪組織中表達(dá)，還在肝臟組織、胰腺1和人表皮（顆粒層角質(zhì)形成細(xì)胞/GK細(xì)胞）中表達(dá)。“血清Vaspin水平在早餐前早晨最高，并且在早餐后2小時(shí)內(nèi)降至最低水平。血清Vaspin水平在午餐和晚餐前也顯示出餐前上升和餐后下降，盡管程度小于早餐。餐間Vaspin濃度在下午中期達(dá)到最低點(diǎn)，并在夜間上升，夜間Vaspin水平的峰值約為最低點(diǎn)水平的250%。在長(zhǎng)時(shí)間禁食后不規(guī)律進(jìn)食顯著降低了血清Vaspin水平，這表明能量攝入本身對(duì)血清Vaspin水平有抑制作用。血清Vaspin濃度的晝夜模式與胰島素和葡萄糖的模式完全相反”。

作為ALPCO在中國(guó)的區(qū)域總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦ALPCO熱銷產(chǎn)品Vaspin ELISA, 96孔。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

方法

Vaspin的酶免疫測(cè)定是一種所謂的夾心測(cè)定法。它利用針對(duì)這種蛋白的特異性和高親和力的多克隆抗體。樣本中的Vaspin與微孔板上固定的第一抗體結(jié)合。隨后，生物素標(biāo)記的抗體轉(zhuǎn)而與Vaspin結(jié)合。洗滌后，將添加鏈霉親和素-過氧化物酶-酶結(jié)合物，它將高度特異性地與生物素結(jié)合，并催化酶反應(yīng)，根據(jù)樣本中Vaspin水平的多少，定量地改變底物的顏色。

樣本

血清樣本可用于此測(cè)定法。

樣本儲(chǔ)存

建議將樣本儲(chǔ)存在-20°C的緊閉塑料管中。

樣本準(zhǔn)備

樣本必須用稀釋緩沖液（VP）稀釋。對(duì)于大多數(shù)測(cè)定（血清樣本，且不預(yù)期有極端值），使用1:4與稀釋緩沖液VP的稀釋比例應(yīng)該是合適的。根據(jù)預(yù)期的Vaspin水平，可以用VP進(jìn)行更高或更低的稀釋。這個(gè)測(cè)試系統(tǒng)的卓越線性允許樣本稀釋從1:2到1:32。人體來源的體液中的Vaspin濃度可能與血清或細(xì)胞培養(yǎng)上清完全不同。

稀釋建議方案：

在PE/PP管中移液210 ?l稀釋緩沖液VP（在大量系列中推薦使用多步移液器），加入70 ?l血清或血漿（稀釋1:4）。混合后，每次測(cè)定使用100 ?l此稀釋液。

技術(shù)建議

不能混合不同批號(hào)的試劑。如果儲(chǔ)存在2 – 8°C、未開封并避免陽光直射，所有試劑和微孔板都穩(wěn)定直至標(biāo)示的有效期。如果適當(dāng)使用，開封后組分的保質(zhì)期為4周。使用前將所有試劑置于室溫（20 - 25°C）。緩沖液中可能的沉淀在使用前必須通過混合和/或加熱溶解。室溫孵育意味著：20-25°C。

特異性：

通過兩種不同的方法研究了所用多克隆抗體的特異性。通過尺寸排除色譜法分離了原生血清樣本中的蛋白質(zhì)，得到的分?jǐn)?shù)進(jìn)行了a) ELISA檢測(cè)，以及b) ELISA陽性的分?jǐn)?shù)也通過西方印跡法進(jìn)行了測(cè)試。圖2顯示ELISA在大約37 kDa處檢測(cè)到一個(gè)信號(hào)，這一點(diǎn)通過西方印跡法得到了確認(rèn)。理論上，Vaspin的分子量為45.2 kDa。與重組Vaspin相比，SEC峰分?jǐn)?shù)的信號(hào)大小相同。計(jì)算出的分子量的差異可能是由于柱子校準(zhǔn)的可變性以及SEC條件的差異，如分?jǐn)?shù)大小和流速造成的。

圖：Vaspin ELISA的特異性。將250?L人血清通過SEC Superdex 10/300GL進(jìn)行分離，分?jǐn)?shù)大小為0.5 ml，流速為0.5 ml/min。樣本用稀釋緩沖液稀釋至1:4。插圖顯示了西方印跡法的結(jié)果，樣本通過10% SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)移，并用生物素標(biāo)記的抗體（1:1000）和鏈霉親和素-過氧化物酶結(jié)合物（1:1500）染色。

文獻(xiàn)參考：

1. Korner, A. et al. Vaspin is related to gender, puberty and deteriorating insulin sensitivity inchildren, Int J Obes 35, 578–586 (2011).

2. Toulza, E. et al. Large-scale identification of human genes implicated in epidermal barrierfunction, Genome Biol 8, R107 (2007).

3. Jeong, E. et al. Circadian Rhythm of Serum Vaspin in Healthy Male Volunteers: Relationto Meals, Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 95, 1869–1875 (2010).

4. Loeffelholz, C. v. et al. Circulating vaspin is unrelated to insulin sensitivity in a cohort ofnondiabetic humans, European Journal of Endocrinology 162, 507–513 (2010).

5. Zhang, L. Li, L. Yang, M. Liu, H. & Yang, G. Elevated circulating vaspin levels weredecreased by rosiglitazone therapy in T2DM patients with poor glycemic control onmetformin alone, Cytokine (2011). 

ALPCO產(chǎn)品種類多樣，可測(cè)樣品來源包括人、大/小鼠、豚鼠、兔、豬、羊、狗、猴等，涉及神經(jīng)生物學(xué)、骨代謝、心血管疾病和氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、糖尿病和肥胖癥、內(nèi)分泌學(xué)、甲狀腺功能、腸胃病學(xué)、免疫學(xué)、生殖激素、抗體和抗原、分子診斷等多個(gè)研究領(lǐng)域，尤以糖尿病和肥胖癥研究領(lǐng)域見長(zhǎng)。

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