異藻藍(lán)蛋白（APC）是從螺旋藻中分離得到的一種藻膽蛋白。與其他藻膽蛋白一樣，APC表現(xiàn)出熒光，并具有高消光系數(shù)和量子產(chǎn)率。它可以使用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)交聯(lián)技術(shù)與抗體和其他蛋白質(zhì)偶聯(lián)，而不會(huì)改變其光譜特性。其在633nm和647nm處的強(qiáng)吸收使其及其串聯(lián)物成為流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用中與紅色激光結(jié)合使用的首選熒光染料之一。APC-AF700和APC Alexa Fluor 700串聯(lián)染料具有相同的結(jié)構(gòu)。它們的主要吸收峰在651nm處，發(fā)射峰在710nm附近。APC-AF750串聯(lián)是APC-Cy7的一個(gè)極好的替代品，提供更高的FRET效率和信號(hào)。它的主要吸收峰在651nm，發(fā)射峰在780nm附近

艾美捷APC-Cy7串聯(lián)染料：

Cat #：B-CHM310/B-CHM316/B-CHM317

規(guī)格：1 mg

儲(chǔ)存：儲(chǔ)存溫度為4°C，避光。

形式：固體

激光器：Laser633

儲(chǔ)存條件：儲(chǔ)存溫度為4°C，避光保存，不得冷凍。

穩(wěn)定性：在適當(dāng)?shù)膬?chǔ)存條件下穩(wěn)定至少6個(gè)月

APC-Cy7串聯(lián)染料使用說(shuō)明：

1.抗體修飾

1） 將抗體修飾試劑（DTT/TCEP）溶于ddH2O中，制備2 mg/ml抗體修飾緩沖液。

2） 使用PBS緩沖液將待標(biāo)記抗體的濃度（純度>90%）調(diào)節(jié)至約5-10 mg/ml。向每毫克抗體中加入10μl抗體修飾緩沖液，輕輕混合。在室溫下攪拌混合物60-90分鐘。

3） 反應(yīng)完成后，將混合物轉(zhuǎn)移到離心過(guò)濾管中，并加入MES緩沖液。離心過(guò)濾器多次以除去過(guò)量的抗體修飾緩沖液。過(guò)濾器中收集的溶液是經(jīng)修飾的抗體，應(yīng)將其調(diào)節(jié)至1-5mg/ml的濃度。

2.APC串聯(lián)激活

1） 將APC串聯(lián)溶于濃度為5-10mg/ml的0.1M PBS（pH 7.4，5mM EDTA）中。

2） 將SMCC溶解在無(wú)水二甲基亞砜中，制備10mg/ml的儲(chǔ)備溶液。

3） 每mg APC串聯(lián)染料添加Sul的SMCC（n（APC串聯(lián)）：n（SMCC）=1:80）。用鋁箔密封反應(yīng)混合物，并在室溫下旋轉(zhuǎn)1小時(shí)，以使APC串聯(lián)上的氨基與琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，形成衍生的APC串聯(lián)。

4） 反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到超濾離心管中，并在4℃、12000g下離心5分鐘以除去濾液。加入500μl MES緩沖液，混合并離心。重復(fù)此步驟5次。

5） 收集活化的APC串聯(lián)溶液。

3.活化的APC串聯(lián)與抗體的結(jié)合

1） 使用MES緩沖液將活化APC串聯(lián)的濃度調(diào)節(jié)至5 mg/ml。為了獲得活化APC串聯(lián)的準(zhǔn)確重量，我們建議使用活化APC串聯(lián)形式測(cè)量的消光系數(shù)（[APC串聯(lián)]=0.14999×A651，其中[APC串聯(lián)]是以mg/ml為單位的濃度，A651是651nm處的吸光度，優(yōu)選在0.3-0.8的范圍內(nèi)）。

2） 將修飾的抗體與活化的APC串聯(lián)以1:1.3的質(zhì)量比混合（每mg修飾的抗體1.3 mg活化的APC串列）。在室溫下進(jìn)行反應(yīng)，避光2小時(shí)。

3） 將NEM溶解在無(wú)水二甲基亞砜（DMSO）中，制備12.5 mg/ml溶液（0.1 M）。在步驟2）的反應(yīng)混合物中，每毫克抗體加入5μl-NEM溶液，以阻斷任何剩余的活性基團(tuán)。

4） 將步驟3）中的溶液轉(zhuǎn)移到離心過(guò)濾管中，并通過(guò)重復(fù)離心去除阻塞緩沖液。

5） 將標(biāo)記的抗體分成等分，添加適當(dāng)?shù)姆栏瘎⒃?20°C下儲(chǔ)存以備將來(lái)使用。

APC-Cy7:

注意事項(xiàng)：

1.激活的APC串聯(lián)應(yīng)在黑暗中冷藏。在貼標(biāo)簽的過(guò)程中，應(yīng)盡可能避免光線(xiàn)照射。

2.封閉試劑和修飾試劑應(yīng)新鮮配制，并立即使用。它們不應(yīng)該存放很長(zhǎng)時(shí)間。

3.標(biāo)記的抗體應(yīng)具有高特異性和不低于90%的純度。單克隆抗體是首選，溶液中不應(yīng)含有游離胺。最好使用PBS。在標(biāo)記之前，抗體應(yīng)該耗盡NaN3和BSA。透析、濃縮和濃度測(cè)量等操作可能會(huì)導(dǎo)致抗體損失。因此，應(yīng)根據(jù)具體情況確定用于標(biāo)記的抗體的適當(dāng)量。

4.由于修飾抗體中引入的基團(tuán)對(duì)再氧化的易感性，修飾后的抗體應(yīng)盡快與活化的APC串聯(lián)偶聯(lián)。

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