PicaGreen dsDNA定量試劑盒*2000次*試劑盒可用于在存在RNA、蛋白質(zhì)和常見污染物的情況下定量測量樣品中的雙鏈DNA。PicaGreen允許對低至低ng/mL的dsDNA進行定量。 試劑盒包含PicaGreen染料、緩沖液和用于測量的DNA標準品。它與熒光計、熒光板讀數(shù)器、比色杯和微體積熒光計兼容。

艾美捷 Biogradetech PicaGreen dsDNA定量試劑盒：

中文名稱：PicaGreen dsDNA定量試劑盒*2000次*

英文名字：PicaGreen dsDNA Quantification Kit *2000T*

Biogradetech貨號：B-CHK001-1mL

規(guī)格：1mL

保存建議：PicaGreen dsDNA定量試劑盒*2000次*儲存條件：4°C&室溫避光。 穩(wěn)定性：在適宜條件下可以儲存6個月。

在分子生物學的試驗過程中,PicoGreen dsDNA 定量試劑盒是熒光檢測雙鏈 DNA 并進行定量的一種產(chǎn)品,這種方法非常靈敏。常用于分子生物學技術(shù)中的:cDNA 文庫的構(gòu)建;用于亞克隆的 DNA 片段純化及應(yīng)用,比如進行 DNA 定量、產(chǎn)物擴增和引物的進一步檢測。 PicoGreen 定量檢測方法簡單、方便,被多家生物制品廠所選擇,成為生物制品殘留DNA 檢測的標準。

操作步驟:

1、試劑制備

PicaGreen dsDNA (Component A )(定量試劑是以 1mL 的濃縮液形式保存在無水的 DMSO(二甲基亞砜)中。實驗當天,配制 2XPicoGreen 試劑的操作溶液,用 1xTE(Component B)按 1:200 的比例稀釋濃縮液。如果要準備足夠的操作溶液測定 20 個樣品,可在 20mL1x TE(Component B)中加入 100μLPicaGreen dsDNA(Component A ) 定量試劑。由于試劑容易吸附到玻璃表面,要在塑料容器中配制。PicaGreen 試劑(Component A )見光易降解,所以應(yīng)將配好的溶液用錫箔包住或放置暗處避光保存。溶液 在配制好數(shù)小時內(nèi)使用,以保證 結(jié)果。

2、DNA 標準曲線

2.1 預(yù)備 1μg/mLdsDNA(Component c)或貯存液于 1x TE 中。根據(jù)在 1cm 光程長度的比色杯中 A260nm 時的吸光度確定 DNA 濃度;相應(yīng)于 μg/mLdsDNA 溶液 A260=0.02。盡管任何純化的 dsDNA 制劑都可用來做標準曲線,但常用的是小牛胸腺 DNA。 用跟被檢測的樣品相似的 DNA 做標準曲線,用或長或短的線型 DNA 片段測定相近大小的酶切片段;質(zhì)粒用于測定質(zhì)粒 DNA。然而大部分線狀 dsDNA 分子,不管其片段長度大小,都會產(chǎn)生大致相等的信號。PicaGreen 試劑測定法在通常污染核酸制劑的幾種復(fù)合物存在的條件下仍能保持線狀,盡管信號強度可能受到影響。因此,為了得到有效的對照處理,被用來做標準曲線的 dsDNA 溶液要用和實驗樣品相同的方式來處理,并且應(yīng)該包含相同的可能存在的污染物。

2.2 要產(chǎn)生從 0.5ng/mL 到 500ng/mL(見表 1)單重復(fù) 8 個點的標準曲線,在 2X 終濃度下配制一系列的 DNA 溶液,混合相同體積的 2XDNA 和 2XPicaGreen 操作溶液,放入10×10mm 比色杯中。混合相同體積的 1XTE 和 2XPicaGreen 操作溶液以備空白對照。避光于室溫下放置 2-5 分鐘。

表1：用 10×10mm 比色杯時 DNA 標準曲線

2.3 孵育后用合適的熒光計測量樣品熒光值。選擇藍色激發(fā)光,用熒光值 的樣品校正儀器。

2.4 測量剩余樣品的熒光值。不同的微型熒光計將給出一個直接的濃度讀數(shù),數(shù)據(jù)可以用來產(chǎn)生 DNA 濃度的標準曲線,下面以 TBS-380 微型熒光計為例。

3、樣品分析

3.1 用 1X TE 稀釋未知 DNA 樣品至需要的體積(10×10mm 比色杯需 1.0mL,微量檢測皿需 25-100μL)。對樣品高度稀釋可以確保任何污染物都被 限度地沖淡。然而也要避免取樣體積太小而無法 吸取的情況。去除樣品中 RNA 和 ssDNA 參照 4 部分。

3.2 在每個樣品中加入 2XPicaGreen 試劑的操作溶液(3.1 節(jié)準備),混合好,將混合物移入合適的比色杯,避光于室溫下放置 2-5 分鐘。3.3 可以對樣品進行不同的稀釋處理重復(fù)測定以確保結(jié)果的準確性。

4、去除樣品中單鏈核苷酸

當 ssDNA 與 dsDNA 等摩爾濃度時,后者的測定受前者的干擾很小。前者濃度 10 倍于后者時,對熒光信號的干擾也不過 10%。但當 DNA 濃度低時,ssDNA 能產(chǎn)生較大干擾在高濃度時,由 RNA 結(jié)合 PicaGreen 試劑產(chǎn)生的熒光值用 RNA 酶處理樣品可消除。RNA 酶 A、酶 T1 結(jié)合核酸酶 S1 能除去所有單鏈核酸,從而保證樣品熒光值是由 dsDNA 產(chǎn)生。(具體做法請查閱相關(guān)的參考文獻)