GloMelt?染料在結(jié)合變性蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域后會發(fā)生熒光增強(qiáng)。因此，該染料可用于檢測蛋白質(zhì)的展開或通過進(jìn)行熱穩(wěn)定性測定（也稱為蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性移動試驗、差示掃描熒光測定或熱熒光測定）來測量蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。

艾美捷GloMelt熱轉(zhuǎn)移蛋白穩(wěn)定性試劑盒（BTM-33021-T）：快速、廉價，可量化蛋白質(zhì)變性溫度的變化，因此可用于篩選影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的條件，如蛋白質(zhì)突變、配體結(jié)合和緩沖劑配方（如pH值、鹽類、洗滌劑和其他添加劑）。這些測定通常迅速（約30分鐘）并在定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行。熱穩(wěn)定性移動方法與高通量篩選兼容，并且需要的蛋白質(zhì)比圓二色譜和差示掃描量熱法等方法要少得多。

與其他環(huán)境敏感染料（如SYPRO? Orange和PROTEOSTAT? TS染料）相比，GloMelt?染料具有明顯的優(yōu)勢。GloMelt?染料在SYBR? Green通道的定量PCR儀器中進(jìn)行了優(yōu)化，因此可以使用較低的反應(yīng)體積和蛋白質(zhì)濃度，產(chǎn)生強(qiáng)烈的信號。GloMelt?染料與高濃度的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑（如甘油和山梨醇）以及蛋白質(zhì)不穩(wěn)定劑（如DTT和咪唑）兼容。與SYPRO? Orange不同，GloMelt?染料在高洗滌劑濃度下表現(xiàn)出色。另一個優(yōu)勢是在熱穩(wěn)定性移動試驗中可以與ROX染料一起使用，這可以通過增加qPCR儀器中重復(fù)一致性來改善結(jié)果，ROX染料是一種被動參考染料。

儲存和處理：

將GloMelt?染料儲存在-20°C的環(huán)境中，并避免光照。按照推薦的儲存條件，GloMelt?染料在收到之日起可穩(wěn)定保存2年。GloMelt?染料是一種潛在的有害化學(xué)物質(zhì)，處理時請遵循一般實驗室安全預(yù)防措施，并根據(jù)當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)將其作為危險化學(xué)廢物處理。GloMelt?染料以200倍濃度的水溶液和20%的二甲基亞砜(DMSO)供應(yīng)。

將ROX參考染料儲存在-20°C的環(huán)境中，并避免光照。按照推薦的儲存條件，ROX可穩(wěn)定保存2年。ROX以40 uM的濃度在10 mM Tris-HCL、0.1 mM EDTA中供應(yīng)。

將山羊IgG對照蛋白儲存在-20°C的環(huán)境中。解凍后，可在4°C條件下保存2年，或重新冷凍。避免多次凍融循環(huán)。山羊IgG對照蛋白以10 mg/mL的濃度在10 mM磷酸鈉、0.15 M氯化鈉、pH 7.2、0.05%偶氮二鈉溶液中供應(yīng)。

光譜特性：

GloMelt?染料吸收/發(fā)射波長：468/507 nm

圖1：對環(huán)境敏感的熒光染料可用于監(jiān)測蛋白質(zhì)的溫度依賴性展開。蛋白質(zhì)的融化溫度（Tm）是蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的一個指標(biāo)

反應(yīng)設(shè)置：

1. 準(zhǔn)備1X GloMelt?工作溶液。將GloMelt?染料解凍并達(dá)到室溫。輕輕搖晃和離心小瓶。使用您選擇的緩沖液（如PBS、TE或水），新鮮制備足夠的10X染料工作儲備液，以供測定的樣品數(shù)量。例如，為了準(zhǔn)備足夠的10X染料用于50個反應(yīng)，每個反應(yīng)體積為20 uL，將5 uL 200X染料加入95 uL PBS，每個管中使用2 uL 10X染料，以獲得最終的1X染料濃度。

注意：我們建議在反應(yīng)中使用1X染料的最終濃度，但可以測試0.5-2X的最終濃度以優(yōu)化您的測定。我們還建議使用20 uL的反應(yīng)體積以節(jié)約試劑，但可以使用多達(dá)100 uL的體積。

2. 在您選擇的緩沖液中準(zhǔn)備感興趣的蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)稀釋至0.5-2.5 ug/uL的最終濃度進(jìn)行測定。也可以使用高達(dá)5 ug/uL的濃度。對于含有IgG的測定，我們發(fā)現(xiàn)0.5-1 ug/uL的最終濃度效果良好。

注意：為了獲得合適的結(jié)果，測試蛋白質(zhì)的估計純度應(yīng)>80%，并且應(yīng)無沉淀物。GloMelt?試劑盒包含可用于初始測定設(shè)置的IgG對照蛋白質(zhì)。每次實驗中不需要運行IgG對照樣品。

3. 在qPCR管或qPCR板上設(shè)置反應(yīng)，并使用光學(xué)密封。反應(yīng)包含染料、測試蛋白質(zhì)、緩沖液，還可以包含測試添加劑和ROX（如通用反應(yīng)設(shè)置所示）。我們建議準(zhǔn)備不含蛋白質(zhì)的反應(yīng)控制樣品（NPCs），包含除了測試蛋白質(zhì)以外的所有反應(yīng)組分。應(yīng)準(zhǔn)備至少3個每個反應(yīng)的重復(fù)樣品，以測試一致性并獲得統(tǒng)計學(xué)上顯著的結(jié)果。

注意：如果您的蛋白質(zhì)在室溫下的穩(wěn)定性未知，建議在冰上進(jìn)行反應(yīng)設(shè)置。如果您的蛋白質(zhì)在室溫下具有熱穩(wěn)定性，可以在室溫下進(jìn)行反應(yīng)設(shè)置。

Biotium公司位于美國加利福尼亞的BAY AREA。該公司一直致力于開發(fā)和生產(chǎn)用于生物醫(yī)學(xué)研究的熒光指示劑及其他特殊生化產(chǎn)品。其產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生 物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、診斷學(xué)、生物化學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、血液流動檢測及大規(guī)模藥物篩選等眾多領(lǐng)域。