T4 DNA連接酶（T4 DNA ligase）的主要功能是連接DNA分子的斷裂端。在DNA復(fù)制、重組或修復(fù)過程中，DNA鏈可能會發(fā)生斷裂或切口，T4 DNA連接酶能夠催化DNA分子的5'磷酸基和3'羥基之間的磷酸二酯鍵形成，從而將DNA片段連接起來，類似于生物界的“502”。除了連接DNA分子的斷裂端，T4 DNA連接酶還可以封閉單鏈RNA或DNA/RNA雜交鏈中的切口，因此在修復(fù)RNA或DNA/RNA雜交鏈的損傷時也能發(fā)揮作用。T4 DNA連接酶是一種重要的酶，在分子生物學(xué)研究和基因工程應(yīng)用中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，用于連接DNA片段、構(gòu)建重組DNA分子和修復(fù)DNA損傷等。

Biogradetech的T4 DNA連接酶由攜帶T4噬菌體gene 30的大腸桿菌產(chǎn)生。該酶催化雙螺旋DNA或RNA之間的5'-磷酸基團(tuán)和3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵。該酶在雙鏈DNA、RNA 或者DNA/RNA復(fù)合物間可修復(fù)單鏈缺刻，并且可以連接有粘性末端或者平末端的DNA片段，但對于單鏈核酸無活性，主要用于限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物DNA片段克隆、基因定點突變與 PCR產(chǎn)物克隆、線性DNA自環(huán)化與修復(fù)雙鏈DNA缺刻。T4 DNA Ligase需要 ATP 作為輔助因子，在室溫下完成粘性末端連接反應(yīng)僅需10分鐘。

艾美捷Fast T4 DNA Ligase 快速T4 DNA連接酶：

貨號 C-BSM205-1000U

名稱 Fast T4 DNA Ligase 快速T4 DNA連接酶

組分 T4 DNA Ligase(Fast) (5 U/ul)  200ul 10×T4 DNA Ligase Buffer    1ml 50% PEG                  1ml

Fast T4 DNA Ligase 快速T4 DNA連接酶使用方法：

1.DNA 插入片段連接至載體DNA（粘性末端連接）

① 于冰上配制如下反應(yīng)體系：

試劑 用量

線性化載體 DNA 20~100 ng

插入片段 DNA 3:1~10:1 (片段：載體摩爾比)

10×T4 DNA Ligase Buffer 2 ul

T4 DNA Ligase 1U (0.2 ul)

Nuclease-Free Water To 20 ul

② 充分混勻并瞬離，22℃溫育10 min；

③ 取1~5 ul的連接產(chǎn)物用于50 ul化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，或者取1~2 ul用于50 ul電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。  

2.DNA插入片段連接至載體DNA（平末端連接）

① 于冰上配制如下反應(yīng)體系：

試劑 用量

線性化載體 DNA 20~100 ng

插入片段 DNA 3:1~10:1 (片段：載體摩爾比)

10×T4 DNA Ligase Buffer 2 ul

50% PEG 2 ul

T4 DNA Ligase 5U (1 ul)

Nuclease-Free Water To 20 ul

② 充分混勻并瞬離，22℃溫育1 h；

③ 取1~5 ul的連接產(chǎn)物用于50 ul化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，或者取1~2 ul用于50 ul電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。  

3.線性DNA自環(huán)化

① 于冰上配制如下反應(yīng)體系：

試劑 用量

線性化載體 DNA 10~50 ng

10×T4 DNA Ligase Buffer 5 ul

T4 DNA Ligase 5U (1 ul)

Nuclease-Free Water To 50 ul

② 徹底混勻并瞬離，22℃溫育10 min；

③ 取 1~5 ul的連接產(chǎn)物用于50 ul化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，或者取1~2 ul用于50 ul電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。  

4.接頭連接

雙鏈寡核苷酸接頭經(jīng)常被用于在插入片段上產(chǎn)生粘性末端。接頭通 常包含限制酶識別位點，在連接后經(jīng)酶切處理產(chǎn)生和克隆載體匹配的粘端。有時候接頭已包含與克隆載體匹配的粘端，此時無需在接頭連接完 成后進(jìn)行插入片段的進(jìn)一步處理。

試劑 用量

線性化載體 DNA 100~500 ng

磷酸化接頭 1-2 ug

10×T4 DNA Ligase Buffer 2 ul

50% PEG 2 ul

T4 DNA Ligase 2U (0.4 ul)

Nuclease-Free Water To 20 ul

② 徹底混勻并瞬離，22℃溫育10 min；

③ 在65℃作用10 min或者70℃作用5 min，進(jìn)行熱失活。   

Biogradetech生命科學(xué)和醫(yī)藥研發(fā)行業(yè)關(guān)鍵原料與試劑的供應(yīng)商：Biogradetech成立于2015年，總部位于美國加利福尼亞州，早期以產(chǎn)品技術(shù)研發(fā)服務(wù)起家，逐步發(fā)展了廣泛的產(chǎn)品線，并將其商業(yè)化銷售，包括蛋白質(zhì)、抗體、酶、培養(yǎng)基、試劑盒和儀器。適用于細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、診斷學(xué)、生物化學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、血液分析和高通量藥物篩選等領(lǐng)域。