研究人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）疾病和紊亂的原因以尋求有效的治療方式需要體外和體內(nèi)疾病模型，這些模型真實的再現(xiàn)了各自的神經(jīng)病理生理情況，同時也通過必要的細胞機制支持神經(jīng)元以提供翻譯結果的治療方式作出反應^1-3。     

      此外，我們需要研究最早的神經(jīng)病理生理變化，因為這些變化為早期診斷和干預提供了絕佳機會。神經(jīng)突觸的結構和功能變化通常是許多神經(jīng)退行性疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中最早的病理變化。

      為了檢測早期的突觸功能障礙，科學家們利用活細胞成像技術來提供單細胞影像，并實時分析實驗條件的變化情況下細胞形態(tài)變化。本通訊討論了活體細胞成像在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和疾病的體外和體內(nèi)研究中的應用。

      設計與生物學相關的體外和體內(nèi)活細胞成像實驗需要健康、成熟的神經(jīng)元，神經(jīng)元需要具有適當?shù)耐挥|結構和功能（即形態(tài)和電活性）（下圖）。主要成像目標是突觸前和突觸后結構和相關蛋白（例如，突觸囊泡蛋白、神經(jīng)遞質(zhì)受體、離子通道、支架蛋白或細胞骨架蛋白[F-actin、微管]），因為它們是最早發(fā)生病理變化的基質(zhì)⁴（下圖）。

      評估突觸結構或功能變化的方法包括測量突觸密度、軸突長度、脊椎密度、節(jié)點（軸突在細胞體上的位置）、樹突分支或電活動⁴。     

      體外培養(yǎng)的哺乳動物神經(jīng)元的活細胞成像，包括人類誘導多能干細胞（hipsc）來源的神經(jīng)元，由于它與人類神經(jīng)元之間具有更大的生物學相關性⁸，能夠揭示與人類神經(jīng)退行性疾病（如阿爾茨海默病（AD）和帕金森病）相關的獨特的機理和功能發(fā)現(xiàn)。載脂蛋白E（apoe-E）是一種與AD發(fā)病密切相關的蛋白，但apoe-E及其代謝產(chǎn)物在神經(jīng)元生理學中的作用尚未得到重視。

      近期研究發(fā)現(xiàn)，分化的SH-SY5Y神經(jīng)母細胞瘤經(jīng)25kDa片段或全長apoe-E長期治療后顯示出神經(jīng)增生（通過活細胞成像評估軸突長度和細胞融合的陽性變化）⁹，初步藥物篩選研究也受益于這種方法。在AD中，兩種最常見的藥物靶點是淀粉樣β蛋白（aβ）和tau蛋白，因為這兩種蛋白都對突觸有早期病理作用^5-7。

      近年來，有學者對HIPSC來源的神經(jīng)元進行了活體細胞成像，篩選出幾種抗病理性Aβ的候選抗體，通過在不同梯度抗體孵育時間和濃度范圍內(nèi)量化軸突長度和樹突分支點的變化來評估陽性免疫治療結果¹⁰。

人誘導神經(jīng)元（INS）分化過程0-21天的活細胞成像

      在另一項Aβ研究中，Hong等人¹¹對活體HIPSC衍生神經(jīng)元進行了成像，用從死后人類大腦提取物中分離出的Aβ低聚物對這些神經(jīng)元進行處理，通過定量分析軸突長度和突觸可塑性的變化，并結合長期電位記錄來評估低聚物的病理生理特性。

      隨著對tau構象敏感的第一個基因編碼的促進共振能量轉移（FRET）傳感器的誕生，tau蛋白成為一項新技術的焦點，該傳感器監(jiān)測了活的hela細胞和永生的HT22海馬神經(jīng)元在藥物治療后，微管（mts）存在和不存在的情況下野生型和病理突變的tau蛋白的構象 ¹²，這個tau-FRET傳感器提供了非常寶貴的定量和定性數(shù)據(jù)，涉及tau與mts結合的調(diào)節(jié)、可溶性與不溶性（病理性）tau的比率和如何影響tau的構象以利于非病理形式。

Tau蛋白構象敏感傳感器（CST）在活細胞中的成像

      體內(nèi)動物模型是體外細胞培養(yǎng)模型的補充，動物神經(jīng)元的活體細胞成像通常使用雙光子顯微鏡進行，這種顯微鏡允許在自然狀態(tài)下和在互聯(lián)支持網(wǎng)絡的較大環(huán)境中觀察功能性神經(jīng)元的單細胞影像¹³，通過這種方式，動物體內(nèi)的活細胞成像產(chǎn)生了變革性，研究者有機會實時可視化的分析細胞動態(tài)過程。

      此外，單細胞體內(nèi)成像可對感覺、行為變化和藥物治療過程中的神經(jīng)元功能反應進行量化¹³。體內(nèi)雙光子活細胞成像被應用于尋找抗帕金森（PD）藥物的靶向α-突觸核蛋白的作用機制¹⁴，以及評估將胚胎細胞移植到受損成人大腦區(qū)域以替換死亡或即將死亡的神經(jīng)原^15-17的可行性和最佳時機、宿主和供體條件。

      此外，體內(nèi)成像可以揭示新的治療方法，MPTP小鼠PD模型活細胞成像顯示，MPTP處理小鼠運動皮質(zhì)神經(jīng)元的結構和功能突觸可塑性受多巴胺能神經(jīng)元選擇性丟失的影響，提高了調(diào)控運動皮質(zhì)特定區(qū)域的神經(jīng)元活動是治療PD相關運動損傷的可行選擇的可能性¹⁸。

PD小鼠模型中運動皮質(zhì)脊柱的動態(tài)變化

      總結

      活體細胞成像技術是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和障礙的寶貴工具，它不僅能讓研究者對基本疾病/障礙生物學進行深入的了解，而且能實時了解藥理、遺傳和行為治療干預的功能后果。再加上超分辨率顯微鏡和自動化活細胞成像技術的進步¹⁹，我們有很好的機會來關注第一次病理性突觸變化，這種變化可以通過早期治療干預來停止或逆轉。

      艾美捷科技能為您提供全套的有價值的研究工具：如Cytoskeleton的用于f-actin、微管、DNA和溶酶體的活細胞成像探針，以及純化的細胞骨架蛋白、活化分析和抗體；iRegene的人源神經(jīng)干細胞（hNSC）細胞株、配套的干細胞培養(yǎng)基及神經(jīng)元定向培養(yǎng)基；StressMarq的活性α突觸蛋白和Tau蛋白等優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品，都可以對這些研究起到很大推動作用。

      Cytoskeleton的活細胞成像相關產(chǎn)品：

      活細胞成像試劑盒：

    廠家內(nèi)部質(zhì)檢：

	Huvec細胞：  Huvec細胞（固定），用SiR-actin染色，共聚焦顯微鏡成像。
	大鼠海馬神經(jīng)元： 用SiR-actin染色培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的STED圖像。肌動蛋白環(huán)（條紋）周期性為180nm。
	MCF10A Cells (3D培養(yǎng)) 用SiR -actin（紅色）染色的MCF10A細胞在基質(zhì)膠中表達H2B-GFP（藍色）的。 LSM 倒置顯微鏡觀測圖
	MCF10A Cells (3D培養(yǎng)) 用SiR -actin（紅色）染色的mcf10a細胞在基質(zhì)膠中表達H2B-GFP（藍色）的。 LSM 倒置顯微鏡觀測圖
	金魚視網(wǎng)膜雙極細胞： 用SiR-tubulin染色的單個分離金魚視網(wǎng)膜雙極細胞的三維投影。顏色光譜代表深度。可見微管從樹突的頂端（頂部）伸入軸突，向下伸入巨大的突觸末端（底部）。
	金魚星形膠質(zhì)細胞: 用SiR-tubulin染色的單個分離的金魚星形膠質(zhì)細胞的三維投影。

      G-LISA 活化檢測試劑盒：

      Actin生化試劑盒：   

      Tubulin生化試劑盒：

       iRegene的人源干細胞株及配套培養(yǎng)試劑盒：   

      StressMarq的活性α突觸蛋白和Tau蛋白，便于快速構建神經(jīng)疾病動物模型：   

      參考文獻：

1. Neurological disease models made clear. Med.(Editorial, published September 2015). 21, 964.

 

2. Schlachetzki J.C. et al. 2013. Studying neurodegenerative diseases in culture models.  Bras. Psiquiatr.35, S92-100.

 

3. Hughes P. et al. 2018. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need? Biotechniques. 43, 575, 577-578, 581-582

 

4. Verstraelen P. et al. 2018. Image-based profiling of synaptic connectivity in primary neuronal cell culture.  Neurosci. 12, 389.

 

5. Hoover B.R. et al. 2010. Tau mislocalization to dendritic spines mediates synaptic dysfunction independently of neurodegeneration. Neuron. 68, 1067-1081

 

6. Spires-Jones T.L. and Hyman B.T. 2014. The intersection of amyloid beta and tau at synapses in Alzheimer’s disease. Neuron. 82, 756-771.

 

7. Bayer T.A. and Wirths O. 2010. Intracellular accumulation of amyloid-beta – a predictor for synaptic dysfunction and neuron loss in Alzheimer’s disease. Front. Aging Neurosci. 2, 8

 

 

8. Unternaehrer J.J. and Daley G.Q. 2011. Induced pluripotent stem cells for modelling human diseases.  Trans. R. Soc. B.366, 2274-2285.

 

9. Munoz S.S. et al. 2018. The serine protease HtrA1 contributes to the formation of an extracellular 25-kDa apolipoprotein E fragment that stimulates neuritogenesis.  Biol. Chem. 293, 4071-4084

 

10. Jin M. et al. 2018. An in vitro paradigm to assess potential anti-Aβ antibodies for Alzheimer’s disease.  Commun.9, 2676.

 

11. Hong W. et al. 2018. Diffusible, highly bioactive oligomers represent a critical minority of soluble Aβ in Alzheimer’s disease brain. Acta Neuropathol.136, 10-40

 

12. Di Primio C. et al. 2017. The distance between N and C termini of tau and of FTDP-17 mutants is modulated by microtubule interactions in living cells.  Neurosci.10, 210.

 

13. White M.D. et al. 2018. In vivo imaging of single mammalian cells in development and disease. Trends Mol. Med.24, 278-293.

 

14. Wrasidlo W. et al. 2016. A de novo compound targeting alpha-synuclein improves deficits in models of Parkinson’s disease. 139, 3217-3236.

 

15. Falkner S. et al. 2016. Transplanted embryonic neurons integrate into adult neocortical circuits. Nature. 539, 248-253.

 

16. Peron S. et al. 2017. A delay between motor cortex lesions and neuronal transplantation enhances graft integration and improves repair and recovery.  Neurosci.37, 1820-1834.

 

17. Wang C. et al. 2016. Infiltrating cells from host brain restore the microglial population in grafted cortical tissue.  Rep.6, 33080.

 

18. Guo L. et al. 2015. Dynamic rewiring of neural circuits in the motor cortex in mouse models of Parkinson’s disease.  Neurosci.18, 1299-1309.

 

19. Shin H.Y. et al. 2018. Using automated live cell imaging to reveal early changes during human motor neuron degeneration. eNeuro. doi: 10.1523/ENEURO.0001-18.2018.

 

      Cytoskeleton公司成立于1993年，專注于生物化學和細胞過程研究中的純化蛋白和便捷試劑盒開發(fā)與生產(chǎn)。公司提供藥物篩選、信號轉導、蛋白質(zhì)轉錄后修飾（PTM）、細胞骨架研究相關的系列試劑盒和產(chǎn)品，尤其以細胞骨架相關研究見長，既能滿足于樣品較少的科學研究，也可以用于小規(guī)模篩選研究和高通量大規(guī)模篩選研究。此外，公司還提供微管蛋白，肌動蛋白，小G蛋白，GAPs，GEFs等現(xiàn)有產(chǎn)品的藥物篩選服務。

      iRegene其核心科學團隊來自于英國劍橋大學和羅斯林研究所。 秉承“睿知有臨，此生長健”的美好愿景，武漢睿健醫(yī)學旨在利用誘導多能干細胞（iPSC）和基因編輯技術推動人類再生醫(yī)學健康事業(yè)的發(fā)展。睿健醫(yī)學是國內(nèi)專注于誘導多能干細胞再生領域，集新技術研發(fā)，技術服務，再生醫(yī)學產(chǎn)品生產(chǎn)，銷售于一體的高科技創(chuàng)新型公司。

       目前公司已經(jīng)開展了多項國際合作，合作方包括英國劍橋大學John Van Geest Centre for Brain Repair，英國Bath大學癌癥研究中心；參與項目包括歐盟Horizon2020干細胞項目，罕見病藥物篩選項目；涉及神經(jīng)退行性疾病，遺傳性疾病，罕見病，癌癥；組織器官再生及藥物篩選等多個方向。 此外，睿健醫(yī)學也是英國知名生物智庫CiteAB以及國際知名生物科技自動化企業(yè)TTP集團的重要戰(zhàn)略合作伙伴。

      StressMarq 在2007年成立于加拿大維多利亞，是一家生物科技公司，專門從事試劑與試劑盒研究。我們有強大的國際經(jīng)銷商網(wǎng)絡，主要為私人和公眾客戶提供經(jīng)我們多次試驗成功的試劑，服務范圍遍及全球50多個國家。

      StressMarq公司的核心技術領域為細胞應激（尤其是熱休克蛋白（HSP）領域，領先全球），離子通道，載體研究，同時在神經(jīng)科學領域推出特有的具有生物活性的Tau蛋白與α-突觸核蛋白。產(chǎn)品領域涉及到：細胞凋亡、細胞信號、通路和轉運、細胞器標志物、熱休克、神經(jīng)生物學、神經(jīng)科學、氧化應激、磷酸化運輸?shù)取tressMarq的優(yōu)勢在于提供四種獨立的產(chǎn)品系列，分別涉及抗體、蛋白、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒及小分子領域。

      作為Cytoskeleton、iRegene、 StressMarq在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技有限公司將為中國客戶提供最全面的Cytoskeleton、iRegene、 StressMarq產(chǎn)品與服務。