活性氧自由基（ROS）是氧氣正常代謝的自然產(chǎn)物，對細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)起著重要作用。在與氧化應(yīng)激相關(guān)的條件下，ROS水平會(huì)顯著增加。ROS的積累可能嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)。氧化應(yīng)激在心血管疾病、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、中風(fēng)、炎癥性疾病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等研究中起著重要作用。ROS檢測可幫助確定氧化應(yīng)激如何調(diào)節(jié)各種細(xì)胞內(nèi)途徑。EZMeta?活性氧自由基（ROS）檢測熒光試劑盒提供了一種簡單、敏感、快速的ROS檢測方法。其原理基于熒光探針DCFH-DA。DCFH-DA是一種細(xì)胞滲透敏感的探針，用于檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基（ROS）。該探針在通過活細(xì)胞膜時(shí)會(huì)被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解為DCFH。DCFH無熒光并且不能穿透細(xì)胞膜，但可以被細(xì)胞內(nèi)ROS氧化并產(chǎn)生熒光的DCF。然后，通過流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡檢測熒光信號(hào)，可以分析細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的水平。

艾美捷Biogradetech活性氧 (ROS) 含量檢測試劑盒：

貨號(hào)：D-AKC1910

規(guī)格：50T / 100T

儲(chǔ)存：儲(chǔ)存于-20°C，避光，保存12個(gè)月

適用樣本：細(xì)胞

提供的材料和儲(chǔ)存條件：

分析程訊：

對于刺激時(shí)間較短的細(xì)胞（通常少于2小時(shí)），建議先加載探針，然后用活性氧自由基陽性對照物或感興趣的藥物刺激細(xì)胞；對于需要長時(shí)間刺激的細(xì)胞（通常超過6小時(shí)），建議在加載探針之前用活性氧自由基陽性對照物或感興趣的藥物刺激細(xì)胞，這里只提供后一種實(shí)驗(yàn)方法，步驟如下：

1. 原位加載探針（僅適用于附著細(xì)胞）

a) 細(xì)胞準(zhǔn)備：在測試前一天放置細(xì)胞板，確保細(xì)胞數(shù)目小于5×10^5/mL。

b) 藥物誘導(dǎo)：去除細(xì)胞培養(yǎng)基，加入無血清稀釋藥物處理細(xì)胞，在黑暗中在37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。實(shí)際誘導(dǎo)時(shí)間取決于藥物特性和細(xì)胞類型。

c) （可選）陽性對照：用無血清培養(yǎng)基稀釋陽性對照物H2O2，從100 mM稀釋到正常工作濃度的100 μM。細(xì)胞在黑暗中孵育37°C，時(shí)間為30分鐘至4小時(shí)。為了提高活性氧自由基的水平，不同細(xì)胞類型的實(shí)際時(shí)間不同。例如，HeLa細(xì)胞需要處理30-60分鐘。注意：陽性對照僅在陽性對照孔中需要，其他實(shí)驗(yàn)組不需要。

d) 活性氧自由基探針的制備：用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，最終濃度為10 μM。

e) 加載活性氧自由基探針：去除處理藥物，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1-2次，加入適量稀釋的DCFH-DA工作溶液，細(xì)胞需要完全覆蓋，例如6孔板通常添加不少于1 mL/孔，96孔板通常添加不少于100 μL/孔。細(xì)胞在37°C培養(yǎng)箱中黑暗中孵育30分鐘。

f) 清洗細(xì)胞：細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗滌1-2次，去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。

2. 收集細(xì)胞并加載探針（適用于附著細(xì)胞和懸浮細(xì)胞）

a) 細(xì)胞準(zhǔn)備：按照標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)細(xì)胞。需要確保用于測試的細(xì)胞狀態(tài)良好。根據(jù)適當(dāng)?shù)姆椒ㄇ鍧嵅⑹占銐驍?shù)量的細(xì)胞。

b) 藥物誘導(dǎo)：收集的細(xì)胞懸浮在適量的稀釋藥物中，在37°C培養(yǎng)箱中黑暗中孵育。實(shí)際誘導(dǎo)時(shí)間可以根據(jù)藥物特性和細(xì)胞類型確定。

c) （可選）陽性對照：用無血清培養(yǎng)基稀釋陽性對照物H2O2，從100 mM稀釋到正常工作濃度的100 μM。細(xì)胞在黑暗中孵育37°C，時(shí)間為30分鐘至4小時(shí)。為了提高活性氧自由基的水平，不同細(xì)胞類型的實(shí)際時(shí)間不同。例如，HeLa細(xì)胞需要處理30-60分鐘。

d) 活性氧自由基探針的制備：用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，最終濃度為10 μM。

e) 探針加載：離心收集細(xì)胞，去除處理藥物，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1-2次，再次離心收集細(xì)胞，加入稀釋的探針，使細(xì)胞密度為1.0×10^6-2.0×10^7。細(xì)胞在37°C培養(yǎng)箱中黑暗中孵育30分鐘。注意：細(xì)胞密度應(yīng)根據(jù)后續(xù)的檢測系統(tǒng)、檢測方法和總檢測量進(jìn)行調(diào)整。例如，對于流式細(xì)胞術(shù)，單管中的細(xì)胞數(shù)目不應(yīng)少于10^4且不超過10^6。

f) 清洗細(xì)胞：用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1-2次，去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。

3.熒光顯微鏡照片

a) 附著細(xì)胞（步驟1.f）可以直接在熒光顯微鏡下觀察；對于懸浮細(xì)胞（步驟2.f），將25-50 μL細(xì)胞懸浮液滴在顯微鏡載玻片上，用蓋玻片覆蓋進(jìn)行觀察。

b) 在熒光顯微鏡下，使用FITC濾光片觀察熒光，并去除背景以觀察熒光變化。

4. 流式細(xì)胞術(shù)的操作和分析方法

a) 附著細(xì)胞（步驟1.f）用胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸浮液；對于懸浮細(xì)胞（步驟2.f），直接收集細(xì)胞。細(xì)胞用0.5-1 mL PBS（0.5-1×10^5/mL）重新懸浮。

b) 在流式細(xì)胞術(shù)中，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。可以實(shí)時(shí)或定時(shí)檢測刺激前后熒光強(qiáng)度的變化。

該試劑僅用于科學(xué)研究領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。