EdUCellProliferation試劑盒，用于成像（綠色熒光）是BrdU測(cè)定的一種新的替代品。EdU（5-乙炔基-2?-脫氧尿苷）是胸苷的核苷類似物，在活性DNA合成過程中被摻入DNA。與BrdU測(cè)定相比，EdU點(diǎn)擊分析不是基于抗體的，因此不需要DNA變性（通常使用HCl或加熱或用DNase消化）來檢測(cè)結(jié)合的核苷。檢測(cè)基于點(diǎn)擊反應(yīng)，這是疊氮化物和萘醌之間銅催化的共價(jià)反應(yīng)，在30分鐘內(nèi)完成。

艾美捷EdU法細(xì)胞增殖成像分析試劑盒（綠色熒光）基本參數(shù)：

目錄號(hào)：D-AKK2030

規(guī)格：100T

儲(chǔ)存：在-20°C下儲(chǔ)存12個(gè)月，避光

EdU法細(xì)胞增殖成像分析試劑盒（綠色熒光）程序分析：

A.細(xì)胞使用EdU標(biāo)記

在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，以96孔板中的貼壁細(xì)胞為例。懸浮細(xì)胞可以在孵育EdU后涂抹（將適量的細(xì)胞加到玻片上，用酒精燈烘干）。涂抹后，染色步驟與貼壁細(xì)胞相同。

1. 在孔板中放置適當(dāng)?shù)牟Ｆ诳字蟹N植適量的細(xì)胞，并在處理細(xì)胞后使其達(dá)到所需的密度。

2. 可選步驟：設(shè)置陰性對(duì)照。在EdU孵育之前加入DNA合成抑制劑羥基脲，按1:1000的比例直接加入陰性對(duì)照孔中，混勻并孵育0.5小時(shí)。

3. 使用細(xì)胞培養(yǎng)基中的10mM EdU溶液制備2倍濃度的EdU工作溶液（20μM）。推薦的最終EdU濃度為10μM，通過將10mM EdU與細(xì)胞培養(yǎng)基按1:500稀釋可以得到2倍濃度的EdU工作溶液（20μM）。

4. 預(yù)熱至37°C的2倍濃度的EdU溶液與含有待測(cè)細(xì)胞的培養(yǎng)基加入相同體積，使96孔板中EdU的最終濃度為1倍。

注意：推薦不要更換所有培養(yǎng)基，因?yàn)檫@會(huì)影響細(xì)胞增殖速率；推薦初始EdU濃度為10μM。

5. 在最適宜的條件下孵育細(xì)胞2小時(shí)（根據(jù)細(xì)胞擴(kuò)展的時(shí)間，一般腫瘤細(xì)胞的孵育時(shí)間為2小時(shí)）。

6. 孵育結(jié)束后，移除培養(yǎng)基，向每個(gè)孔中加入0.1mL固定液（含有3.7%甲醛的PBS溶液），在室溫下孵育15分鐘。

7. 去除固定液，用0.1mL BSA工作溶液（1倍濃度）洗滌每個(gè)孔中的細(xì)胞，孵育5分鐘。重復(fù)3次。

8. 去除洗滌液，向每個(gè)孔中加入0.1mL穿透劑（含有0.5% Triton X-100的PBS溶液），在室溫下孵育15分鐘。

9. 去除穿透劑，用0.1mL BSA工作溶液（1倍濃度）洗滌每個(gè)孔中的細(xì)胞，孵育5分鐘。重復(fù)2次。

10. 進(jìn)入C步驟。

B.在活體動(dòng)物中標(biāo)記EdU

這個(gè)實(shí)驗(yàn)以6周齡小鼠為例，其他動(dòng)物中EdU的標(biāo)記，請(qǐng)參考相關(guān)文獻(xiàn)。

1. 對(duì)于小鼠，根據(jù)10-200 mg/kg的劑量，將EdU與PBS混合制成一定濃度，可以通過腹腔注射、局部注射到特定組織或器官，或者加入飲用水中。具體劑量與使用的動(dòng)物的類型、體重和使用方式有關(guān)，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)，因此建議首次使用時(shí)探索EdU的濃度，或直接使用50 mg/kg的濃度進(jìn)行測(cè)試。如果之前使用過BrdU進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以參考BrdU的最終濃度作為EdU的最終濃度。EdU需要單獨(dú)購買。

2. 可選步驟：設(shè)置陰性對(duì)照。在EdU處理期間加入DNA合成抑制劑羥基脲，與EdU溶液按照1000 mg/kg的濃度配制。羥基脲需要單獨(dú)購買。

3. 經(jīng)過24小時(shí)或根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)確定的適當(dāng)時(shí)間后，迅速殺死小鼠，取出必要的組織，并根據(jù)常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。也可以根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)整EdU標(biāo)記的時(shí)間。

4. 對(duì)于冰凍切片：

（1）加入適量的固定溶液（含3.7%甲醛的PBS），室溫孵育15分鐘。

（2）取出固定劑，用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗滌每個(gè)孔中的細(xì)胞5分鐘。重復(fù)3次。

（3）取出洗滌劑，向每個(gè)孔中加入0.1mL滲透劑（含有0.5%Triton X-100的PBS），并在室溫下孵育15分鐘。

（4）去除滲透劑，并用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗滌每個(gè)孔中的細(xì)胞5分鐘。重復(fù)2次。

（5）抗原修復(fù)（可選）：如果同時(shí)需要對(duì)靶蛋白進(jìn)行免疫熒光染色，并且需要抗原修復(fù)，可以使用合適的抗原修復(fù)液或自制的合適抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)。

（6）轉(zhuǎn)到步驟C。

5.對(duì)于石蠟切片：

（1）脫蠟：在二甲苯中脫蠟5-10分鐘，然后換成新鮮二甲苯，然后脫蠟5-10分鐘。無水乙醇和無水乙醇分別脫蠟5分鐘和3分鐘。95%乙醇3分鐘。85%乙醇3分鐘.75%乙醇3分鐘50%乙醇3分鐘.PBS 5分鐘。

（2）抗原修復(fù)（可選）：如果同時(shí)需要對(duì)靶蛋白進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，并且需要抗原修復(fù)，可以使用合適的抗原修復(fù)液或自制合適的抗原修補(bǔ)液進(jìn)行抗原修復(fù)。

注意：如果使用蛋白酶K或胰蛋白酶進(jìn)行抗原修復(fù)，必須反復(fù)清洗，否則殘留的酶會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。

（3）轉(zhuǎn)到步驟C。

C.EdU檢測(cè)

注：在該步驟中，每個(gè)孔使用100μL反應(yīng)混合物。對(duì)于其他孔板或片，可以根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整反應(yīng)混合物的體積，但必須按比例添加反應(yīng)組分。

1.根據(jù)下表制備Click-iT反應(yīng)混合物。

注意：按照表中列出的順序添加配料是很重要的；否則，反應(yīng)不會(huì)順利進(jìn)行。在制備后15分鐘內(nèi)使用Click-iT反應(yīng)混合物。

2.取出溶液，向每個(gè)樣品中加入100μL Click-iT反應(yīng)混合物，并在室溫下孵育細(xì)胞30分鐘，避光。

3.取出反應(yīng)混合物，用0.1mL BSA洗滌溶液（1x）洗滌孔中的細(xì)胞5分鐘，然后取出洗滌溶液。

4.可選步驟：核染色（1xHoechst 33342）或抗體標(biāo)記。

重要提示：孵化過程中應(yīng)避免光線照射。如果您不需要其他染色，請(qǐng)?jiān)诜趸笾苯舆M(jìn)行圖像和分析。

5.用熒光顯微鏡（Ex/Em=501/525nm）分析樣品中標(biāo)記的DNA，用Ex/Em=360/460nm檢測(cè)細(xì)胞核。

該試劑僅用于科學(xué)研究領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。

Biogradetech生命科學(xué)和醫(yī)藥研發(fā)行業(yè)關(guān)鍵原料與試劑的供應(yīng)商：Biogradetech成立于2015年，總部位于美國加利福尼亞州，早期以產(chǎn)品技術(shù)研發(fā)服務(wù)起家，逐步發(fā)展了廣泛的產(chǎn)品線，并將其商業(yè)化銷售，包括蛋白質(zhì)、抗體、酶、培養(yǎng)基、試劑盒和儀器。適用于細(xì)胞生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、診斷學(xué)、生物化學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、血液分析和高通量藥物篩選等領(lǐng)域。