ELISpot和FluoroSpot實驗中刺激物的優化選擇與應用

要讓ELISpot或FluoroSpot實驗提供有價值的信息，通常需要在體外對細胞進行刺激。刺激物不僅可以用于識別抗原特異性免疫反應，還可以作為實驗對照。選擇合適的刺激物主要取決于細胞類型和實驗的具體需求。刺激物可以是單克隆抗體、肽庫、合成化合物，或者是從細菌或植物中提取的天然物質。Mabtech提供多種經過驗證和優化的多克隆和抗原特異性刺激劑試劑，適用于ELISpot和FluoroSpot實驗。其中，大多數試劑為單克隆抗體或肽庫（我們稱之為PepPools）。PepPools可用于實驗對照，也可用于識別抗原特異性免疫反應。

針對特定研究問題的刺激

PepPools有兩種形式：定義明確的肽庫和掃描肽庫：

掃描肽庫：不需要事先了解表位信息，其設計目的是覆蓋整個蛋白質或特定結構域。它們通常以15個氨基酸的肽段形式生產，且每個肽段之間有11個氨基酸的重疊，從而覆蓋整個目標蛋白質。15個氨基酸的肽段能夠刺激CD4+ T細胞，當加入細胞培養中時，它們可以被蛋白酶進一步修剪成較短的肽段，從而刺激CD8+ T細胞。因此，掃描肽庫可用于刺激任何物種的任何T細胞。一般來說，如果您不確定研究群體中的HLA/MHC組成，掃描肽庫是一個更安全的選擇。

定義明確的肽庫：在產品名稱中會標明特定物種，它們包含針對特定HLA/MHC分子的已定義肽段。這些肽段已被Mabtech或其他研究者鑒定為免疫優勢肽段，因此能夠產生強烈的免疫反應。如果您確定研究群體中的HLA組成能夠被覆蓋，那么定義明確的肽庫是首選。

Mabtech提供針對一些常見病原體的肽庫，并且產品列表在不斷增加。如果您正在考慮使用Mabtech的肽庫進行研究，但尚未購買ELISpot或FluoroSpot試劑盒，可以查看Mabtech的Path Kits——這些是包含肽庫的完整且經過驗證的試劑盒。請注意，Mabtech的肽庫可用于研究問題，但由于例如EBV（Epstein-Barr病毒）和CMV（巨細胞病毒）在人類群體中高度流行，某些肽段庫也可以用作陽性對照。

為什么Mabtech有這么多針對SARS-CoV-2的肽段庫？因為它們可以用于不同的目的并回答不同的問題。

SARS-CoV-2 (SNMO)肽庫(貨號3622-1) 是用于解答有關COVID-19免疫的一般性問題的首選產品。然而，如果您發現SARS-CoV-2 (SNMO)肽庫沒有涵蓋您所需的HLA類型，那么SARS-CoV-2 (S1)掃描肽庫(貨號3629-1)將是一個更好的選擇。拉霍亞Sette實驗室（Yu等人，《細胞宿主與微生物》，2022年）的一項研究強調了如何通過分別檢測針對刺突蛋白和非刺突蛋白的IFN-γ反應來區分疫苗接種和感染引發的免疫反應。因此，SARS-CoV-2 (NMO)肽庫（貨號3632-1）可以與SARS-CoV-2 (NMO)肽庫（貨號3632-1）結合使用，以區分SARS-CoV-2感染和疫苗接種。最后，SARS-CoV-2奧密克戎BA.1 (S1)，掃描肽庫（貨號3636-1）可用于評估對奧密克戎BA.1突變的反應。為什么Mabtech有這么多針對SARS-CoV-2的肽段庫？因為它們可以用于不同的目的并回答不同的問題。

請注意，肽庫小瓶可以合并使用，以便更好地契合當前的研究問題。也許您只想觀察結核病（TB）的反應性，而不關心是哪種特定抗原引發了反應？也許您對CD4與CD8的反應不感興趣，而只關心總的T細胞反應？也許您想合并肽庫（例如EBV+CMV），以便在陽性對照中覆蓋更多的HLA類型？這是可行的！唯一的風險是DMSO（二甲基亞砜）的濃度過高，可能導致細胞膜損傷并對細胞產生毒性。為了解決這個問題，請僅在第一個小瓶中加入40微升DMSO，然后將所有內容物轉移到下一個小瓶中，如果需要合并三個小瓶，則繼續轉移到下一個。記得用PBS沖洗小瓶。

作為實驗對照的刺激物

用于T細胞多克隆激活的常用試劑是植物血凝素（PHA）或佛波酯/離子霉素（PMA/Ionomycin）。然而，在Mabtech看來，抗原特異性刺激通常也更適合用于對照孔，因為這些試劑經過了很好的定義，并且能夠誘導細胞更“生理學上正確”的激活。抗原特異性刺激的一個缺點是，它們可能并不適用于所有HLA類型或物種。

T細胞多克隆激活

某些選定的抗CD3抗體可以作為T細胞的多克隆激活劑。Mabtech提供針對人和猴CD3的單克隆抗體，這些抗體能夠誘導多種細胞因子的釋放。使用體外生產的單克隆抗體，確保了批次間低變異性——這比植物凝集素等試劑更具優勢。

植物凝集素：植物血凝素（PHA）和刀豆蛋白A（ConA）是強效的T細胞激活劑。目前，Mabtech不提供植物凝集素，但PHA和ConA可以從許多不同的供應商處購買，并且有不同效力的產品可供選擇。

抗原特異性T細胞刺激

已知能夠誘導特異性反應的抗原也作為陽性對照具有重要價值。ELISpot或FluoroSpot的一個主要應用領域是檢測抗原特異性人CD8 T細胞產生的IFN-γ。為此，Mabtech開發了一種抗原特異性的陽性對照，即CEFRAS (CD8)肽庫（貨號3637-1）。Mabtech還提供用于刺激CD4 T細胞的CEFTA (CD4)肽庫（貨號3617-1），以及一個更全面的CEF版本，即CEF擴展肽庫（貨號3618-1）。這三種肽段庫也可以用于流式細胞術。

CEFRAS (CD8)肽庫（貨號3637-1）能夠刺激CD8+ T細胞產生例如IFN-γ、IL-2、顆粒酶B、穿孔素和TNF-α等細胞因子。該肽段庫包含210種肽段，這些肽段是來自18種病原體的MHC I類限制性T細胞表位，包括柯薩奇病毒B4、人腺病毒5型、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、水痘-帶狀皰疹病毒、Epstein-Barr病毒、巨細胞病毒、人類皰疹病毒6型、人乳頭瘤病毒、流感病毒A型、JC多瘤病毒、麻疹病毒、結核分枝桿菌、呼吸道合胞病毒、SARS-CoV-2、弓形蟲、天花病毒和黃熱病病毒。該肽段庫旨在刺激T細胞，覆蓋來自不同種族背景的廣泛HLA類型。肽段在偶聯后進行了封端處理。

CEF (CD8)肽庫（貨號3616-1）由23種病毒肽組成，能夠刺激人CD8 T細胞產生主要為IFN-γ的反應，覆蓋約90%的白種人。這些肽段包含來自巨細胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）和流感病毒的MHC I類限制性T細胞表位，旨在刺激具有多種HLA類型的供體的T細胞。它還能在許多個體的細胞中誘導穿孔素和顆粒酶B的反應。除了作為陽性對照外，CEF肽段庫還適用于標準化程序。

CEF擴展肽庫（貨號3618-1）由32種病毒肽組成，能夠刺激人CD8 T細胞產生主要為IFN-γ的反應，覆蓋約90%的白種人。這些肽段包含來自巨細胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）和流感病毒的MHC I類限制性T細胞表位，旨在刺激具有多種HLA類型的供體的T細胞。它還能在許多個體的細胞中誘導穿孔素和顆粒酶B的反應。

CEFTA (CD4)肽庫（貨號3617-1）由35種MHC II類限制性病毒肽組成，這些肽段來自人巨細胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）、流感病毒、破傷風毒素和腺病毒5型。CEFTA肽段庫能夠刺激人CD4 T細胞產生IFN-γ、IL-2、IL-5和IL-13，推薦作為使用人外周血單個核細胞（PBMCs）進行ELISpot和FluoroSpot實驗的陽性對照。

CD4和CD8細胞的分別耗竭，揭示CEF (CD8)肽庫（貨號3616-1）確實主要刺激CD8 T細胞。

多克隆單核細胞/樹突狀細胞刺激

Toll樣受體（TLRs）的配體可以作為陽性對照來刺激單核細胞和樹突狀細胞。從細菌中純化的脂多糖（LPS）通過TLR4發揮作用，是例如IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的強效刺激物。化合物R848是TLR7/8的配體，能夠刺激例如IL-1β的分泌。

目前，Mabtech不提供LPS。Mabtech不單獨提供R848，但它（連同IL-2）是StimPack(貨號3660-1，StimPack: Memory B cells, human)的一部分，因此可以從Mabtech這里獲得。

多克隆B細胞刺激

記憶B細胞在分泌可檢測量的抗體之前需要多克隆刺激。這些細胞可以使用StimPack(貨號3660-1，StimPack: Memory B cells, human)或StimPack（貨號3661-1，StimPack: Memory B cells, mouse）進行刺激；這是一種合成化合物R848（TLR 7/8激動劑）和重組IL-2的混合物。