PI4激酶活性檢測是一種競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），其信號與測量到的PI(4)P的數(shù)量成反比。在加入PI(4)P檢測試劑之前，使用EDTA停止酶反應(yīng)。然后將這種混合物轉(zhuǎn)移到PI(4)P檢測板進(jìn)行競爭性結(jié)合。使用過氧化物酶標(biāo)記的二抗和比色法檢測來檢測PI(4)P檢測試劑與板結(jié)合的數(shù)量。

磷脂酰肌醇4-磷酸（PI(4)P）是在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的最多的單磷酸磷脂酰肌醇。它由磷脂酰肌醇4-激酶（PI4K）產(chǎn)生，該激酶磷酸化磷脂酰肌醇的肌醇環(huán)的D-4位置。根據(jù)它們的分子質(zhì)量、由去污劑和腺苷的調(diào)節(jié)，PI 4-激酶被分類為兩種類型，II型和III型。II型PI 4-激酶包括PI4KIIa（PI4K2A），它參與了許多生物過程，從細(xì)胞生長到內(nèi)吞和外排。它還是腫瘤生長的新調(diào)節(jié)器，并在高爾基體內(nèi)產(chǎn)生富含PtdIns4P的區(qū)域。PI4KIIb（PI4K2B）主要是胞質(zhì)的，它被招募到膜上并刺激PI(4,5)P2的合成。III型PI 4-激酶，PI4KIIIa（PI4K3A），在丙型肝炎病毒復(fù)制中發(fā)揮作用。這些病毒利用PI4KIIIa產(chǎn)生富含PI(4)P的環(huán)境，增加細(xì)胞中PI(4)P的水平。PI4KIIIb（PI4KB）在有絲分裂期間調(diào)節(jié)高爾基體的重組。由于其調(diào)節(jié)分泌顆粒釋放的能力，這種酶對于葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌至關(guān)重要。所有這些都使PI 4-激酶成為一系列生物功能、疾病狀態(tài)和感染的有趣靶標(biāo)。

PI4激酶活性測定被設(shè)計用于檢測和定量PI4-激酶反應(yīng)的最終產(chǎn)物PI（4）P。

艾美捷PI4K活性ELISA（#EEB-K-4000K）：

分類：試劑盒與檢測

篩選：活性，激酶

運輸溫度：根據(jù)目的地使用干冰和/或凝膠冰運輸——產(chǎn)品可能分兩個盒子運輸

儲存：第一部分在4-8°C下儲存；第二部分在-80°C下儲存

PI4K活性ELISA檢測設(shè)計：

Echelon公司的PI 4-激酶活性ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）旨在檢測并定量PI 4-激酶反應(yīng)的最終產(chǎn)物，即PI(4)P。PI4-激酶活性ELISA是一種競爭性ELISA，其信號與測量到的PI(4)P的數(shù)量成反比。在加入PI(4)P檢測試劑之前，使用EDTA停止酶反應(yīng)。然后將這種混合物轉(zhuǎn)移到PI(4)P檢測板進(jìn)行競爭性結(jié)合。使用過氧化物酶標(biāo)記的二抗和比色法檢測來檢測PI(4)P檢測試劑與板結(jié)合的數(shù)量。

PI4K活性ELISA檢測結(jié)果：

PI4-激酶活性可以通過將含有酶反應(yīng)產(chǎn)物的孔的吸收值與標(biāo)準(zhǔn)曲線中的值進(jìn)行比較來估計。將獲得的吸光度值與PI（4）P的log（以pmol為單位）/標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行繪圖，以使用S型劑量-反應(yīng)（可變斜率）相關(guān)性生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過從酶反應(yīng)獲得的吸光度值進(jìn)行插值，確定pmol中的PI（4）P水平。見下圖。

左圖：用GraphPad軟件進(jìn)行非線性回歸分析，生成PI（4）P標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用對數(shù)（激動劑）與響應(yīng)——可變斜率（四參數(shù)）分析。為了獲得Z佳結(jié)果，使用0 pmol PI（4）P和空白對照。

右圖：反應(yīng)在室溫下進(jìn)行3小時，用0.33mg/mLPI底物（K-4001K）和1.11mATP振蕩。

PI4K活性ELISA文獻(xiàn)參考：

1. Jiang, X. et. al. 2022. Targeting PI4KA sensitizes refractory leukemia to chemotherapy by modulating the ERK/AMPK/ OXPHOS axis. Theronostics 12: 6972-6988.

2. Sun, A. et. al. 2003. PPhosphatidylinositol 4-kinase IIIβ mediates contraction-induced GLUT4 translocation and shows its anti-diabetic action in cardiomyocytes. Cellular and Molecular Life Sciences