酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISpot）是一種用于定量分析分泌分析物細(xì)胞數(shù)量的靈敏方法。細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子、免疫球蛋白或其他目標(biāo)蛋白在分泌后以及整個(gè)刺激過程中會(huì)被特異性抗體立即捕獲。這種即時(shí)捕獲使得ELISpot成為一種極為靈敏的夾心法檢測，靈敏度可達(dá)單細(xì)胞水平。ELISpot檢測原理：將細(xì)胞培養(yǎng)在包被有特異性捕獲抗體的孔底部的膜表面，并在有或無刺激物的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。因此，細(xì)胞分泌的目標(biāo)蛋白會(huì)被立即捕獲。經(jīng)過適當(dāng)?shù)姆跤龝r(shí)間后，去除細(xì)胞，并使用檢測抗體檢測分泌的分析物。通過使用產(chǎn)生沉淀產(chǎn)物的底物，最終結(jié)果是在膜表面形成可見的斑點(diǎn)。每個(gè)斑點(diǎn)對應(yīng)一個(gè)分泌蛋白的單個(gè)細(xì)胞的“足跡”。

ELISpot實(shí)驗(yàn)流程示意圖

1. 用捕獲抗體包被培養(yǎng)板

ELISpot培養(yǎng)板是一種塑料微孔板，其96個(gè)孔的底部都有一層聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，這與僅由塑料制成的ELISA培養(yǎng)板不同。PVDF膜提供了更大的膜表面積，從而增加了可以結(jié)合的捕獲抗體的量；這一特性對于成功的ELISpot實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。

PVDF膜在高倍放大鏡下類似海綿

1.1 ELISpot培養(yǎng)板（PVDF膜ELISpot板）

Mabtech可提供兩種類型的ELISpot培養(yǎng)板：MSIP 和MAIPSWU 

MSIP培養(yǎng)板底部附有塑料保護(hù)墊，有透明（貨號(hào)3654-TP-10）和白色（貨號(hào)3654-WP-10）兩種形式可供選擇。這兩種顏色的板子在ELISpot讀板儀中呈現(xiàn)略有不同的外觀，但并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。MSIP板的一個(gè)關(guān)鍵特征是它在左上角有一個(gè)“切角”。

MAIPSWU培養(yǎng)板，也被稱為ELIIP，是白色形式的。它沒有底部保護(hù)墊，但是底部有一個(gè)可拆卸的托盤。在洗滌步驟中，可以將培養(yǎng)板從托盤中取出。MAIPSWU培養(yǎng)板的一個(gè)關(guān)鍵特點(diǎn)是它在頂部和底部的右上角有兩個(gè)“切角”。

1.2 乙醇預(yù)處理和培養(yǎng)板包被（*務(wù)必仔細(xì)操作）

就像一塊干海綿一樣，PVDF膜在能夠吸收（結(jié)合）所需量的捕獲抗體之前需要先被潤濕。需要使用乙醇來達(dá)到這個(gè)目的，因?yàn)橐掖伎梢允鼓ぷ兊糜H水。此外，使用推薦濃度的捕獲抗體（這可能會(huì)因分析物而異，但通常為15 ug/ml）可以優(yōu)化斑點(diǎn)的外觀。如果你將捕獲抗體稀釋到低于推薦濃度，你可能會(huì)得到模糊不清的斑點(diǎn)，這些斑點(diǎn)很難計(jì)數(shù)。

1.3 如何包被ELISpot板

1.21 向包被的所有孔中加入新配制的乙醇（用99.5%的原液在無菌水中稀釋）。乙醇與膜接觸后，膜會(huì)立刻變成淡灰色，這表明PVDF已經(jīng)被激活。如果你打算包被多個(gè)培養(yǎng)板，一次只處理一個(gè)或兩個(gè)培養(yǎng)板，以確保在乙醇的短暫孵育時(shí)間內(nèi)完成操作。不要讓乙醇停留時(shí)間過長！

-MSIP培養(yǎng)板——向每個(gè)孔中加入20 ul乙醇（35%）。乙醇在孔中停留時(shí)間不超過1分鐘。

-MAIPSWU培養(yǎng)板——向每個(gè)孔中加入50 ul乙醇（70%）。乙醇在孔中停留時(shí)間不超過2分鐘。

1.2.2 對于MAIPSWU培養(yǎng)板，倒空培養(yǎng)板，并用無菌水洗滌5次（每次200 ul/孔）。對于MSIP培養(yǎng)板，你可以先在孔中加入無菌水，而無需移除乙醇，然后用無菌水洗滌5次（每次200 ul/孔）。

1.2.3 倒空培養(yǎng)板。加入用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋的包被抗體（100 ul/孔）。我們通常推薦包被抗體濃度為15 ug/ml（每孔1.5 ug抗體），但請查看具體產(chǎn)品的實(shí)驗(yàn)方案以獲取詳細(xì)信息。將包被有抗體溶液的培養(yǎng)板在4-8°C下放置過夜。

培養(yǎng)板處理tips: 在實(shí)驗(yàn)過程中，不要讓培養(yǎng)板的膜變干。如果在乙醇預(yù)處理過程中培養(yǎng)板的膜變干了——不要驚慌，只需重復(fù)乙醇預(yù)處理步驟即可。小貼士！在洗滌步驟中，先將最后一次洗滌的液體留在孔中，然后準(zhǔn)備好下一步所需的所有物品，再倒空培養(yǎng)板。

輕輕處理培養(yǎng)板，注意不要對培養(yǎng)板的底部施加壓力。握住培養(yǎng)板的邊緣，而不是頂部或底部，并且在倒空培養(yǎng)板時(shí)避免使用過大的力量。不要讓移液器的槍頭接觸到膜，因?yàn)檫@可能會(huì)損壞膜并導(dǎo)致出現(xiàn)假象。

確保加入的溶液/試劑能夠覆蓋孔。在移液時(shí)也要避免產(chǎn)生氣泡，因?yàn)闅馀菘赡軙?huì)阻礙試劑到達(dá)孔的底部。溶液覆蓋不全或產(chǎn)生氣泡可能會(huì)導(dǎo)致在顯色后出現(xiàn)空白孔。

當(dāng)需要在無菌環(huán)境中操作時(shí)，例如在層流罩中，使用多通道移液器來洗滌培養(yǎng)板。當(dāng)不需要無菌條件時(shí)（請查看產(chǎn)品說明書），可以使用ELISA培養(yǎng)板自動(dòng)洗板器，但要確保調(diào)整洗滌器噴頭的位置，以適應(yīng)ELISpot培養(yǎng)板較淺的孔。

2. 向培養(yǎng)板中加入細(xì)胞和刺激物

無論是自己包被培養(yǎng)板，還是使用Mabtech提供的預(yù)包被培養(yǎng)板，到這個(gè)階段，ELISpot培養(yǎng)板已經(jīng)準(zhǔn)備好接受你的細(xì)胞（在添加200 ul與用于細(xì)胞培養(yǎng)的相同培養(yǎng)基以封閉培養(yǎng)板，并在室溫下孵育30分鐘之后——請遵循實(shí)驗(yàn)方案）。作為一種基于細(xì)胞的方法，細(xì)胞的活性對于成功的ELISpot實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。細(xì)胞在有或無激活刺激物（抗原或多克隆刺激劑）的條件下進(jìn)行孵育，通常在適當(dāng)?shù)臏囟龋话闶?7℃。孵育時(shí)間應(yīng)允許細(xì)胞最佳地分泌分析物，因此可以從幾小時(shí)到幾天不等。建議所有條件下都設(shè)置三份重復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1 幾乎所有細(xì)胞來源都可以使用——只要細(xì)胞是活的

ELISpot幾乎可以應(yīng)用于任何細(xì)胞來研究蛋白質(zhì)分泌。目前已經(jīng)有多種細(xì)胞的研究成果，包括人血液細(xì)胞、小鼠脾細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、黏膜組織細(xì)胞、異質(zhì)細(xì)胞群、純化的均質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞克隆。至少在人類樣本中，最常用的細(xì)胞是外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）。它們可以通過密度梯度離心（例如使用Ficoll）從血液中獲得。得到的PBMCs可以直接使用，也可以冷凍保存以供日后使用。細(xì)胞冷凍和解凍的要求如下：

細(xì)胞質(zhì)量對于獲得可靠的結(jié)果至關(guān)重要。

使用活細(xì)胞比例高、凋亡細(xì)胞或死亡細(xì)胞比例低的樣本，將使您獲得成功的最大可能性。這不僅適用于ELISpot，而且適用于任何基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。如果您的樣本中含有高比例的死亡細(xì)胞，您不能依賴最終結(jié)果，因?yàn)檫@些結(jié)果是基于反應(yīng)細(xì)胞（斑點(diǎn)形成單位）與總細(xì)胞的比例得出的。

如果操作得當(dāng)，凍存和解凍細(xì)胞并不是問題。但需要注意的是，外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）應(yīng)在采血后盡快制備。這是因?yàn)閺牟裳蟪^大約8小時(shí)的血液樣本中制備的細(xì)胞可能會(huì)受到粒細(xì)胞的污染，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果必須在制備前儲(chǔ)存血液樣本（例如，如果您在下午晚些時(shí)候收到樣本，需要過夜保存），則可以通過以下方法獲得高質(zhì)量的PBMCs：

- 輕輕攪動(dòng)血液樣本。

- 用PBS或RPMI將血液樣本按1:1的比例稀釋。

- 使用商業(yè)耗竭試劑盒從血液樣本中耗竭粒細(xì)胞。

2.2 選擇適合您細(xì)胞的培養(yǎng)基

培養(yǎng)基對細(xì)胞的健康至關(guān)重要。Mabtech推薦使用含有L-谷氨酰胺和10%胎牛血清（FCS）的RPMI 1640培養(yǎng)基用于大多數(shù)細(xì)胞。在Mabtech，通常會(huì)在培養(yǎng)基中添加HEPES以維持細(xì)胞培養(yǎng)的pH值，并添加抗生素以降低污染的風(fēng)險(xiǎn)。由于RPMI 1640可能并非您實(shí)驗(yàn)的最佳培養(yǎng)基，您必須查閱相關(guān)資料，檢查哪種培養(yǎng)基最適合您所研究的細(xì)胞。一般來說，我們推薦使用FCS作為血清來源。不同批次的血清在成分和功能上可能存在差異，因此在用于ELISpot之前，明智的做法是測試新的血清批次。所選用的血清應(yīng)能夠支持細(xì)胞培養(yǎng)并產(chǎn)生低背景染色，即不應(yīng)引起細(xì)胞激活或蛋白質(zhì)分泌。我們建議您不要使用同源血清（例如，用于人類樣本的人類血清），因?yàn)樗赡芎心蛩銠z測的分析物和/或異嗜性抗體，這兩者都可能引起背景噪聲。如果在您的實(shí)驗(yàn)中不能使用胎牛血清（FCS），可以使用含有特定蛋白質(zhì)的無血清培養(yǎng)基作為血清的替代品。在我們測試過的所有無血清培養(yǎng)基中，AIM-V最適合用于ELISpot實(shí)驗(yàn)。無論您選擇哪種細(xì)胞培養(yǎng)基，至關(guān)重要的是在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，包括在添加細(xì)胞之前的封閉/調(diào)節(jié)步驟，都要使用相同的培養(yǎng)基。使用相同的培養(yǎng)基可以確保細(xì)胞在每個(gè)步驟中的環(huán)境保持一致，從而減少可能通過非特異性刺激影響最終結(jié)果的變量數(shù)量。

Mabtech內(nèi)部使用的培養(yǎng)基：RPMI 1640, 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 100 ug/mL penicillin, 100 ug/mL streptomycin

2.3 選擇合適的細(xì)胞數(shù)量

此時(shí)，培養(yǎng)板已經(jīng)用捕獲抗體包被，并在室溫下用細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)節(jié)（封閉）至少1小時(shí)。在將細(xì)胞加入培養(yǎng)板之前，您需要對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并將細(xì)胞濃度調(diào)整到所需的濃度。細(xì)胞計(jì)數(shù)可以通過自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或使用顯微鏡進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色來完成。由于只有活細(xì)胞才能分泌分析物，因此請確保在細(xì)胞計(jì)數(shù)中排除死亡細(xì)胞，并且如果可能的話，排除凋亡細(xì)胞。如果細(xì)胞濃度低于所需濃度，需要通過離心來濃縮細(xì)胞。

以下幾點(diǎn)需要注意：

- 如果不確定合適的細(xì)胞數(shù)量，可以從每孔250,000個(gè)細(xì)胞開始。每孔的細(xì)胞數(shù)量必須根據(jù)細(xì)胞類型和預(yù)期的分泌細(xì)胞頻率進(jìn)行調(diào)整：預(yù)期的反應(yīng)細(xì)胞頻率越低，每孔所需的細(xì)胞數(shù)量就越高。如果預(yù)期頻率是1/10,000個(gè)細(xì)胞，您將需要每孔大約250,000個(gè)細(xì)胞。相反，當(dāng)頻率較高時(shí)，例如1/100個(gè)細(xì)胞，每孔加入50,000個(gè)細(xì)胞就足夠了。一般來說，抗原特異性反應(yīng)需要更高的細(xì)胞數(shù)量（例如，每孔250,000個(gè)細(xì)胞），而多克隆/絲裂原陽性對照（例如，PHA，每孔50,000個(gè)細(xì)胞）則不需要那么多細(xì)胞。

- 細(xì)胞“喜歡”與其他細(xì)胞接觸。在ELISpot中測量的斑點(diǎn)形成單位的數(shù)量并不總是與總細(xì)胞數(shù)量相關(guān)，因?yàn)樾枰欢〝?shù)量的細(xì)胞才能實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)募?xì)胞間接觸，從而實(shí)現(xiàn)最佳刺激。例如，在分析PBMC樣本中的抗原特異性T細(xì)胞時(shí)，每孔的總細(xì)胞數(shù)量不應(yīng)少于200,000個(gè)細(xì)胞。

- 避免渦旋。使用移液槍輕輕重懸細(xì)胞和沉淀物。

- 在將細(xì)胞加入ELISpot培養(yǎng)板之前，有時(shí)刺激細(xì)胞是有益的。對于需要較長時(shí)間才能開始分泌的分析物，可以在將細(xì)胞加入ELISpot培養(yǎng)板之前對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)刺激（最好在圓底聚丙烯管或培養(yǎng)板中進(jìn)行，以增加細(xì)胞接觸）。在某些情況下，這是一種良好的實(shí)踐，例如，用R848 + IL-2刺激記憶B細(xì)胞72小時(shí)，以促進(jìn)其分化為分泌免疫球蛋白的漿細(xì)胞。如果您選擇預(yù)刺激，重要的是要注意，細(xì)胞在加入ELISpot培養(yǎng)板之前必須進(jìn)行洗滌，以避免膜的背景染色。

2.4 接種并刺激細(xì)胞

當(dāng)您選擇了適合實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)量后，終于可以將細(xì)胞接種到培養(yǎng)板上并進(jìn)行刺激了。除了您感興趣的刺激物外，我們建議您同時(shí)設(shè)置三種對照：

選擇用于對照刺激的相關(guān)化合物在很大程度上取決于細(xì)胞類型和您實(shí)驗(yàn)的性質(zhì)。刺激物可以是單克隆抗體（T細(xì)胞的抗CD3抗體）、肽段（CD8?T細(xì)胞的CEFRAS肽池，或CD4?T細(xì)胞的CEFTA肽池）、合成化合物（B細(xì)胞的R848+IL-2），或者是從細(xì)菌或植物中純化的物質(zhì)（T細(xì)胞的PHA）。在Mabtech看來，使用肽池或單克隆抗體進(jìn)行抗原特異性刺激是更可取的，因?yàn)檫@些試劑的特性已經(jīng)明確。

對于所有類型的刺激，抗原特異性或多克隆，Mabtech推薦以下兩種技術(shù)：

I. 先加刺激物，再加細(xì)胞	II. 將細(xì)胞和刺激物混合后再加入板
采用這種方法時(shí)，刺激物和細(xì)胞將分別加入培養(yǎng)板中。當(dāng)依次向每個(gè)孔中加入等體積的刺激物和細(xì)胞（各50微升）時(shí)，刺激物和細(xì)胞懸浮液應(yīng)按最終實(shí)驗(yàn)濃度的2倍進(jìn)行配制。細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)細(xì)胞/毫升時(shí)，每孔將有250,000個(gè)細(xì)胞。至關(guān)重要的是要先加入刺激物，然后再加入細(xì)胞。在細(xì)胞接種后，不要再向孔中加入任何東西，因?yàn)檫@可能會(huì)將細(xì)胞推向孔的邊緣，從而導(dǎo)致結(jié)果不理想。	在試管中將細(xì)胞和刺激物混合至最終實(shí)驗(yàn)濃度。每孔加入100微升；細(xì)胞濃度為2.5×10?個(gè)細(xì)胞/毫升時(shí)，每孔將有250,000個(gè)細(xì)胞。由于細(xì)胞會(huì)持續(xù)在試管中沉淀，記得要小心重懸細(xì)胞。

如果您的樣本只占據(jù)了培養(yǎng)板的一部分，那么請用培養(yǎng)基（每孔100ul）填滿周圍的孔，以減少在孵育過程中樣本的水分蒸發(fā)。

將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱: 在將細(xì)胞和刺激物加入培養(yǎng)板后，下一步就是將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中。一般來說，培養(yǎng)箱的溫度應(yīng)設(shè)置為37℃，二氧化碳濃度為5%。在孵育細(xì)胞時(shí)，需要注意以下兩點(diǎn)：①用鋁箔包裹培養(yǎng)板，盡管大多數(shù)培養(yǎng)箱能夠維持最佳的濕度水平，但用鋁箔包裹培養(yǎng)板是一種良好的實(shí)踐，可以降低細(xì)胞培養(yǎng)基蒸發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。②將培養(yǎng)板并排放置，而不是堆疊放置。不要在培養(yǎng)箱中堆疊培養(yǎng)板。堆疊培養(yǎng)板可能會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)板之間出現(xiàn)不均勻的條件（例如，溫度、二氧化碳濃度、蒸發(fā)率等），這可能會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響斑點(diǎn)數(shù)量。

3. 讓抗體捕獲分析物

與ELISA不同，ELISpot在孔底使用特異性捕獲抗體，在分泌后立即以及在整個(gè)刺激過程中捕獲細(xì)胞因子、免疫球蛋白或其他目標(biāo)蛋白。這就是ELISpot如此靈敏的原因。當(dāng)培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中時(shí)，您現(xiàn)在只需等待抗體捕獲分析物。需要注意的是：①不同分析物具有不同的動(dòng)力學(xué)，在確定最佳細(xì)胞孵育時(shí)間時(shí)，要考慮蛋白質(zhì)分泌的動(dòng)力學(xué)。有些分析物，如顆粒酶B，在刺激超過48小時(shí)后才完全分泌，而另一些分析物，如干擾素γ，僅需12小時(shí)后即可進(jìn)行分析。②在孵育期間不得移動(dòng)培養(yǎng)板，避免在孵育期間移動(dòng)培養(yǎng)板，因?yàn)檫@可能會(huì)對斑點(diǎn)形成產(chǎn)生負(fù)面影響。即使是微小的移動(dòng)也應(yīng)避免，因此要輕柔地關(guān)閉培養(yǎng)箱門。

4. 加入檢測抗體

在孵育步驟之后，細(xì)胞已經(jīng)響應(yīng)刺激而分泌了分析物，而分析物已被包被在培養(yǎng)板上的特異性抗體捕獲。現(xiàn)在是進(jìn)行檢測的時(shí)候了。這可能顯而易見，但還是要說一下：在ELISpot實(shí)驗(yàn)中，您檢測的是曾經(jīng)存在并分泌您正在研究的分析物的細(xì)胞的“足跡”。因此，首先需要將細(xì)胞洗掉：倒空培養(yǎng)板，并用PBS（每孔200微升）洗板5次。ELISpot基于一種酶促檢測系統(tǒng)。對于大多數(shù)試劑盒，檢測步驟是使用生物素化的檢測抗體，隨后使用與酶結(jié)合的鏈霉親和素來完成（“兩步檢測”）。然而，對于某些分析物，Mabtech提供了一種直接與酶結(jié)合的檢測抗體（“一步檢測”）。

兩步檢測: 檢測抗體與生物素結(jié)合，生物素是一種對鏈霉親和素具有高親和力的小分子。加入這種生物素化的檢測抗體是第一步。在第二步中，引入一種與檢測抗體上的生物素分子強(qiáng)烈結(jié)合的鏈霉親和素-酶結(jié)合物（見步驟5）。加入合適的底物完成斑點(diǎn)顯色（見步驟6）。由于每個(gè)檢測抗體上有多個(gè)生物素分子，而每個(gè)鏈霉親和素-酶結(jié)合物又有多個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，因此信號(hào)被放大。

一步檢測: 選擇直接與酶結(jié)合的檢測抗體可以減少實(shí)驗(yàn)步驟的數(shù)量。這節(jié)省了時(shí)間，但與兩步檢測系統(tǒng)相比，信號(hào)放大程度較低。然而，靈敏度的差異很小，而且重要的是，稍微低一點(diǎn)的靈敏度對于某些實(shí)驗(yàn)設(shè)置是有益的，因?yàn)樗部梢越档捅尘靶盘?hào)。

5. 加入鏈霉親和素-酶綴合物

一旦生物素化的檢測抗體與分析物結(jié)合，就到了加入鏈霉親和素-酶綴合物的時(shí)候了。需要注意的是，如果檢測抗體是直接與酶結(jié)合的，您可以跳過這一步。

Mabtech使用的酶是堿性磷酸酶（ALP）或辣根過氧化物酶（HRP）。ALP和HRP催化不同的化學(xué)反應(yīng)，因此需要不同的底物。Mabtech推薦使用BCIP/NBT-plus(貨號(hào)3650-10)用于基于ALP的ELISpot，以及使用TMB(貨號(hào)3651-10)用于基于HRP的ELISpot試劑盒（更多細(xì)節(jié)見步驟6）。一般來說，您可以選擇使用ALP或HRP；這兩種酶都適用于大多數(shù)應(yīng)用。如果您是ELISpot領(lǐng)域的新人，Mabtech建議您選擇ALP。這是因?yàn)镠RP/TMB反應(yīng)在某些實(shí)驗(yàn)設(shè)置中非常迅速，因此更難在最佳時(shí)間點(diǎn)停止反應(yīng)。此外，BCIP/NBT-plus的斑點(diǎn)可以持久保留，而TMB的斑點(diǎn)則會(huì)隨著時(shí)間的推移而褪色。

6. 加底物

在ELISpot實(shí)驗(yàn)中，底物需要能夠形成沉淀，即在被酶催化后沉淀到孔底。這種沉淀形成了我們所說的“斑點(diǎn)”。市場上有很多種沉淀型底物，但Mabtech推薦使用BCIP/NBT-plus(貨號(hào)3650-10)用于ALP，以及使用TMB(貨號(hào)3651-10)用于HRP。這兩種底物都具有很高的靈敏度，并且能夠產(chǎn)生清晰、容易評(píng)估的斑點(diǎn)。

在ELISpot實(shí)驗(yàn)中，顯色時(shí)間取決于分析物、檢測抗體、酶結(jié)合物、所用底物以及分泌的分析物量等因素。如果您使用的不是Mabtech提供的試劑，可能需要對檢測抗體和鏈霉親和素-酶結(jié)合物進(jìn)行梯度稀釋實(shí)驗(yàn)，以找到最佳工作濃度。如果試劑由Mabtech提供，您可以直接按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。一般來說，顯色至陽性對照孔中的斑點(diǎn)清晰可見即可。顯色時(shí)間因試劑和實(shí)驗(yàn)條件不同而有所差異，但通常以分鐘計(jì)，而非小時(shí)。使用Mabtech的ELISpot Plus或ELISpot Pro試劑盒時(shí)，HRP-TMB反應(yīng)（2-10分鐘）比ALP-BCIP/NBT-plus反應(yīng)（3-15分鐘）更快。需要注意的是，過度顯色可能導(dǎo)致背景變暗，降低斑點(diǎn)對比度。因此，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)為每個(gè)項(xiàng)目、分析物和樣本類型找到最佳顯色時(shí)間是一個(gè)良好的實(shí)踐。

終止反應(yīng)的方法取決于您使用的是BCIP/NBT-plus還是TMB：

7. 斑點(diǎn)分析

在分析之前，培養(yǎng)板必須完全干燥。如果您不著急，可以將培養(yǎng)板放置一夜使其自然干燥。為了將干燥時(shí)間縮短到大約30分鐘，Mabtech通常將培養(yǎng)板倒置放在層流罩中。如果您使用的是帶有底部保護(hù)墊的MSIP培養(yǎng)板，在將其放入層流罩之前，請小心地拆卸底部的保護(hù)墊（例如，使用鉗子）。

雖然可以用光學(xué)顯微鏡分析ELISpot培養(yǎng)板，但為了節(jié)省大量時(shí)間并減少錯(cuò)誤，Mabtech建議您使用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)讀板儀。在分析培養(yǎng)板時(shí)，重要的是要認(rèn)識(shí)到，盡管讀板儀中有許多過程是自動(dòng)化的，但您可以決定要計(jì)數(shù)哪些斑點(diǎn)。使用Mabtech Apex?軟件（適用于ASTOR和IRIS），默認(rèn)的計(jì)數(shù)設(shè)置適用于大多數(shù)情況。

然而，類似于流式細(xì)胞術(shù)中對細(xì)胞群體進(jìn)行分選，您可以使用大小和強(qiáng)度的設(shè)置來確定您認(rèn)為相關(guān)的斑點(diǎn)。由于ELISpot非常靈敏，因此在陰性對照孔中出現(xiàn)斑點(diǎn)并不罕見。這是正常的！Mabtech強(qiáng)烈建議您不要從“真實(shí)”斑點(diǎn)中減去這些斑點(diǎn)，而是使用一種統(tǒng)計(jì)分析方法，將陰性對照孔中的斑點(diǎn)納入考慮，以判斷您是否觀察到陽性反應(yīng)。

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