Flipper-TR ^® 是一個活細胞熒光膜張力探針，它打破了迄今為止只有生物物理學家使用定制設備才掌握的技術優(yōu)勢所形成的技術壁壘。Flipper-TR膜張力探針通過使用標準熒光壽命測量簡化了測定方法，這里我們更詳細地介紹一下Flipper-TR的背景知識。

背景：   

脂質膜是動態(tài)的流體結構（約4nm），這是實現生物學功能的必要條件，因為它們必須改變形狀和張力，使細胞能夠參與基本的細胞和亞細胞生理功能，如遷移、細胞擴散、吞噬、細胞分裂、內吞作用、機械傳導和代謝等。因此，要實現這些功能膜張力會受到持續(xù)的調節(jié)，而膜張力又反過來調節(jié)細胞的生長、發(fā)育、運動、內吞和代謝。由于膜在這些細胞過程中被重塑，膜的彎曲、撕裂和拉伸是很常見的。膜形狀和張力的空間和時間的變化是非常重要的測量參數，可以更好的幫助我們了解膜張力是如何被調節(jié)的，以及它如何調節(jié)這些基本的細胞過程。

膜張力測量通常依賴于低分辨率和緩慢的物理方法來測定壓力和膜內張力。例如，測量膜張力的標準技術包括用夾在光學鑷子中的珠子將膜管從質膜上拔出——這項技術有許多方法和技術上的限制。由于這些原因，研究者們迫切需要一種能夠實時快速測量體內膜張力變化的新穎、靈敏、可靠、無創(chuàng)的研究工具。

Flipper-TR^®膜張力探針介紹：

v熒光膜張力探針Flipper-TR^®(Spirochrome, Ltd.)的面世解決了這些挑戰(zhàn)，它可以搭配FLIM(熒光壽命成像顯微鏡)可以實現對活細胞膜的可視化染色。Flipper-TR®是一種活細胞熒光膜張力探針，是第一個為機械生物學領域開發(fā)的熒光膜張力探針。Flipper-TR®的熒光壽命與膜張力密切相關，利用FLIM可將不同壽命的熒光轉換成不同的顏色顯現出來，因此可以通過熒光和顏色及年度即可精確直觀的測量膜內張力的時空分布。Flipper-TR®開辟了一個全新的領域，它提供了一種靈敏、可靠和無創(chuàng)的方法，通過這種方法可以快速、實時地測量活細胞的膜張力(圖1)。

圖1. Flipper-TR感知高滲休克處理后的細胞膜張力變化

左側：與 Flipper -TR染色的細胞的圖像^®   高滲休克之前（上圖）和后（下圖）。

灰色程度代表熒光強度，不同顏色代表不同熒光壽命（藍-紅：0-6納秒）

右側：直方圖顯示高滲休克后的壽命變化，圖片由Colom等人提供。

熒光Flipper -TR ^®探針的工作原理是特異性地靶向細胞質膜，通過報告熒光壽命變化來反映膜張力變化情況。它是Flipper探針家族中最先進的成員，它通過機械載體上的兩個扭曲的二硫噻吩的扭轉角和極化來感知脂質雙層膜結構的變化。Flipper -TR ^®自發(fā)插入到細胞的質膜中，只有插入到脂質膜中才會發(fā)出熒光，通過FLIM(熒光壽命成像顯微鏡)檢測熒光的強度及顏色即可判斷膜張力的大小，Flipper -TR ^®探針具有廣泛的吸收和發(fā)射光譜; 通常在488nm處進行激發(fā)，而發(fā)射光譜則在575和625nm之間（圖2）。

圖2. Flipper-TR的工作原理及吸收/發(fā)射光譜

A.Flipper-TR機制及其與不同張力膜相互作用的示意圖

左側：Flipper-TR的基本分子結構

右側：Flipper-TR在低張力扭曲（綠色）和高張力平行排列（紅色）

B.對乙酸乙酯中的Flipper-TR溶液進行絕對掃描和發(fā)射掃描，并將結果繪制在同一張圖上。

點狀橙色線激發(fā)光，實心橙色線為發(fā)射光。

染色和FLIM成像的詳細步驟可以在參考文獻中找到（點擊了解）。

圖3. Flipper-TR在酵母細胞中的染色

Flipper-TR ^® 適用于范圍廣泛的種屬：包括細菌，哺乳動物， 植物和酵母。

對Flipper-TR染色的酵母細胞進行低滲透性choc（左）或高滲性choc（右）處理。

Flipper-TR的熒光壽命不同處理條件下高低變化，不同顏色表示不同的熒光壽命。

圖片由UNIGE的Roux集團的M. Riggi提供。

Flipper -TR探針的常見問題解答^® 

什么是FLIM顯微鏡以及它如何用于Flipper-TR？

FLIM顯微鏡全稱熒光壽命成像顯微鏡（Fluorescent Lifetime Imaging Microscopy）。膜張力研究的重要性在于，在Flipper-TR之前，膜張力測量需要耗費巨大的人力和昂貴的設備，但現在Flipper-TR卻可以簡單的適配當前顯微鏡來實現高靈敏度的張力測量，其設備可從許多供應商處獲得，它原理是基于記錄熒光團激發(fā)后發(fā)射的時間來反映膜張力的變化，其通常非常快，大約1-10納秒（ns），在FLIM成像過程中，可將熒光壽命的差異通過時間來展示，一般來說，較短的壽命為綠色，中等壽命為黃色，較長的壽命為橙色和紅色。FLIM還可以與其他高分辨率顯微技術（如全內反射熒光（TIRF）或受激發(fā)射耗盡（STED）顯微鏡）相結合，用于高空間分辨率檢測。

FLIM顯微鏡需要配備許多科學顯微鏡供應商提供的時間分辨光檢測器，例如PicoQuant的升級套件（https://www.picoquant.com/news/item/picoquants-flim-fcs-upgrade-kit-now-supports-zeiss -lsm780-and-leica-sp2），參考文獻1描述了有關FLIM顯微鏡實驗裝置的更多細節(jié)。

圖4 . FLIM結構和時間分辨彩色編碼細胞圖像示意圖。

左側：標準FLIM顯微鏡結構圖

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右側：Flipper -TR^®染色的細胞 ，灰度表示熒光強度，不同顏色代表熒光壽命。

圖片由Colom等人提供     Flipper-TR是瑞士Spirochrome SA的注冊商標。

Flipper-TR探針如何檢測熒光壽命變化？

熒光Flipper-TR®探針通過特異性靶向細胞質膜，并通過其熒光壽命變化來反映膜張力變化。Flipper-TR®自發(fā)地插入細胞的質膜中，并且僅在插入脂質膜時才會激發(fā)熒光。探針通過機械載體上的兩個扭曲的二硫噻吩之間的扭轉角和極化改變來感知脂質雙層膜結構的變化（參見圖5）。當處于緊張狀態(tài)時（二硫噻吩并排），發(fā)射壽命短（2-4ns），而在松弛狀態(tài)下（二硫噻吩扭曲），發(fā)射壽命則更長（4.1-8.0ns）。方差（cv）約為0.3ns（cv = 4-15％），這允許在分辨率細微變化的情況下進行高分辨率分析，在FLIM成像過程中，可將熒光壽命的差異通過時間來展示，一般來說，較短的壽命為綠色，中等壽命為黃色，較長的壽命為橙色和紅色（見圖5）

圖5. Flipper-TR的結構和張力檢測機制示意圖

左邊：Flipper-TR的基本分子結構

右邊：Flipper-TR低張力時扭曲（綠色）和高張力時并列排布（紅色）

這些探針的濾光片組件是什么？

Flipper-TR探針使用長分離濾光片組進行可視化，因為其激發(fā)峰值比發(fā)射峰值短100 nm以上。因此，理想的濾光片組是488 +/- 20nm的激發(fā)波長和575-675 +/- 40nm的發(fā)射波長（圖3）。時間分辨測量方法允許非常低的背景，它在水性環(huán)境中具有低熒光，詳情參見下面的問題4。

為什么Flipper-TR探針與其他質膜探針相比具有低背景？

Flipper-TR探針在諸如組織培養(yǎng)基或固定緩沖液等水環(huán)境中的背景非常低，因為它是完全扭曲的狀態(tài)，容易形成膠束并自我淬滅（參考文獻3）。插入膜后，其扭曲度變小，開始發(fā)出高熒光（見圖2）。

Flipper-TR探頭在室溫下是否穩(wěn)定？

探針在室溫下以粉末形式穩(wěn)定幾天。在無水DMSO中溶解后后（不要使用舊的打開過的DMSO瓶子，可以使用Sigma或Spectrum Chemicals的干燥DMSO瓶子。在-20°C下冷凍和解凍是穩(wěn)定的，但不建議將其分成小份進行儲存，因為它在這些條件下會降解。

Flipper-TR對細胞有毒嗎？

在數據表中給定的條件下操作，探針對細胞無毒的。根據細胞類型和培養(yǎng)條件，細胞一般可存活2-4天, 且熒光亮度不會有太大變化。

Flipper-TR探針染色哪些生物和組織？

目前所有已知的生物都可用Flipper-TR染色，包括組織培養(yǎng)細胞，新鮮的組織切片，哺乳動物細胞，昆蟲細胞，植物細胞，酵母和細菌。

Flipper-TR探針是否適用于3D細胞培養(yǎng)？

   探針能夠在3D培養(yǎng)條件下進行細胞染色。   

膜中的量子產率和消光系數是多少？

乙酸乙酯中的量子產率= 0.30。

艾美捷科技為您提供Cytoskeleton的Flipper-TR^®活細胞膜張力檢測探針 ：

參考文獻：   

1.Colom A et al. 2018. A fluorescent membrane tension probe. Nat. Chem. 10, 1118–1125.

2.Dal Molin M. et al. 2015. Fluorescent flippers for mechanosensitive membrane probes. J. Am. Chem. Soc. 137, 568-571.

3.Soleimanpour S. et al. 2016. Headgroup engineering in mechanosensitive membrane probes. Chem. Commun. (Camb). 52, 14450-14453.

4.Riggi M et al. 2018. Decrease in plasma membrane tension triggers PtdIns(4,5)P2 phase separation to inactivate TORC2. Nat. Cell Biol. 20, 1043–1051.

5.FLIM microscopy: Lakowicz JR et al. 1994. Emerging biomedical and advanced applications of time-resolved fluorescence spectroscopy. J Fluoresc. 4(1):117-36. doi: 10.1007/BF01876666.

 Cytoskeleton公司成立于1993年，專注于生物化學和細胞過程研究中的純化蛋白和便捷試劑盒開發(fā)與生產。公司提供藥物篩選、信號轉導、蛋白質轉錄后修飾（PTM）、細胞骨架研究相關的系列試劑盒和產品，尤其以細胞骨架相關研究見長，既能滿足于樣品較少的科學研究，也可以用于小規(guī)模篩選研究和高通量大規(guī)模篩選研究。此外，公司還提供微管蛋白，肌動蛋白，小G蛋白，GAPs，GEFs等現有產品的藥物篩選服務。

作為Cytoskeleton在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技有限公司將為中國客戶提供最全面的Cytoskeleton產品與服務。