ELISpot和FluoroSpot是開發(fā)免疫療法以及細(xì)胞基因療法過程中的理想效力檢測方法。它們能夠?yàn)镃AR-T細(xì)胞的功能、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）的活性、癌癥疫苗的效力以及使用AAV或其他病毒載體的基因療法提供關(guān)鍵的見解。如今，細(xì)胞和基因療法（CGT）、先進(jìn)治療藥物產(chǎn)品（ATMP）以及免疫療法的開發(fā)速度比以往任何時候都要快。這些療法通過修改患者自身的細(xì)胞，甚至引入新的基因來恢復(fù)正常功能，從而治療從遺傳性疾病到癌癥的廣泛疾病。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）針對CGT和ATMP評估的指南強(qiáng)調(diào)了全面免疫分析的重要性，并將細(xì)胞因子分泌檢測視為評估這些療法效力和安全性的必要工具。盡管流式細(xì)胞術(shù)能夠?yàn)榧?xì)胞群體及其功能提供有價值的見解，但它可能無法完全捕捉到由CGT和ATMP引發(fā)的細(xì)胞因子譜的細(xì)微差別。細(xì)胞因子分泌檢測，包括ELISpot和FluoroSpot，能夠填補(bǔ)這一空白，并在細(xì)胞水平上提供特定細(xì)胞因子分泌反應(yīng)的詳細(xì)圖譜。

CAR-T細(xì)胞療法

CAR-T細(xì)胞療法：收集的免疫細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)過基因工程改造，引入嵌合抗原受體（CAR）基因，從而賦予它們識別癌細(xì)胞并增強(qiáng)其殺傷能力的特性。這些改造后的CAR-T細(xì)胞隨后在培養(yǎng)中大量擴(kuò)增，然后重新輸注回患者體內(nèi)。

CAR-T細(xì)胞療法利用患者的免疫系統(tǒng)力量來對抗癌癥。通過重新編輯患者的T細(xì)胞以靶向特定的癌癥抗原，這種個性化的方法已經(jīng)促成了六種不同的獲得FDA批準(zhǔn)的療法，用于治療像白血病和淋巴瘤這樣的血液癌癥，為治療以前難以應(yīng)對的癌癥提供了新的策略。根據(jù)FDA的考量，細(xì)胞因子釋放檢測在CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的開發(fā)中至關(guān)重要，確保這些創(chuàng)新療法的安全性和有效性。這種療法不僅標(biāo)志著我們在抗癌斗爭中邁出了重大一步，還展示了精準(zhǔn)醫(yī)療的潛力，能夠提供更具針對性、更有效且侵入性更小的癌癥療法。

那么，CAR-T細(xì)胞的功能在開發(fā)過程中是如何進(jìn)行測試的呢？體外和體內(nèi)評估都很重要，以確保其對癌細(xì)胞的療效。體外效力檢測方法，如細(xì)胞毒性或“殺傷實(shí)驗(yàn)”、鉻釋放實(shí)驗(yàn)以及基于流式細(xì)胞術(shù)的方法，可以檢測CAR-T細(xì)胞是否誘導(dǎo)靶細(xì)胞死亡。理想情況下，您希望測試CAR-T細(xì)胞在靶向癌細(xì)胞存在時是否通過脫顆粒和細(xì)胞因子釋放而被激活，這正是ELISpot和FluoroSpot可以發(fā)揮關(guān)鍵作用的地方，因?yàn)樗鼈冊跈z測IFN-γ、顆粒酶B、穿孔素、IL-2或TNF-α分泌細(xì)胞方面具有極高的靈敏度。Mabtech甚至專門為這一目的開發(fā)了一種FluoroSpot試劑盒(貨號FSP-013609-TD-2)：FluoroSpot Path：人類免疫療法效力（三色），該 FluoroSpot Path 試劑盒用于通過 FluoroSpot 檢測法計數(shù)分泌人 IFN-γ、顆粒酶 B 和 TNF-α 的細(xì)胞。

在體內(nèi)，CAR-T細(xì)胞的治療效果不僅通過腫瘤體積縮小、生存率和利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的表型分析來評估，還可以通過利用ELISpot和FluoroSpot的再激反應(yīng)來評估。從動物模型或患者體內(nèi)分離出CAR-T細(xì)胞，并用靶向癌細(xì)胞進(jìn)行再刺激，以評估脫顆粒和細(xì)胞因子釋放情況。這些技術(shù)共同為CAR-T細(xì)胞的功能提供了全面的圖景，指導(dǎo)對療法進(jìn)行改進(jìn)，以實(shí)現(xiàn)臨床成功。

CAR-T細(xì)胞的功能可以用FluoroSpot來評估，方法是用表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原（TAA）的癌細(xì)胞或TAA本身直接刺激細(xì)胞。功能細(xì)胞將分泌感興趣的分析物（IFN- γ、顆粒酶B、穿孔素、IL-2或TNF-α），這些分析物可以用FluoroSpot檢測到。一旦CAR-T細(xì)胞被認(rèn)為具有功能，就該在臨床試驗(yàn)環(huán)境中評估它們的療效了。輸注后，可以通過PBMC樣本收集CAR-T細(xì)胞，再次通過與靶細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)行ELISpot或FluoroSpot評估其功能。這將表明將CAR-T細(xì)胞輸注到患者或動物模型中是否會影響其功能。此外，監(jiān)測不良反應(yīng)對于評估治療的安全性和耐受性至關(guān)重要。在這里，細(xì)胞因子風(fēng)暴可能是一種不良事件，可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)化的ELISA試劑盒檢測患者或動物血清中的IL-6水平輕松評估。此外，治療應(yīng)無熱原，并且可以使用幾種 單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定法（MAT）（IL-6 ELISA、IL-1b ELISA和IL-6/IL-1b FluoroSpot）進(jìn)行評估。除了CAR-T細(xì)胞療法外，TCR（T細(xì)胞受體）療法作為一種能夠以更高特異性靶向更廣泛癌癥抗原的強(qiáng)大方法正在興起。這些療法改造患者的T細(xì)胞以表達(dá)針對癌癥抗原的特定TCR，從而增強(qiáng)其抗擊癌癥的能力。此外，CAR-NK療法（即經(jīng)過改造的自然殺傷細(xì)胞）也逐漸受到關(guān)注，因?yàn)樗鼈兡軌蛟跓o需預(yù)先致敏的情況下靶向腫瘤，可能降低細(xì)胞因子釋放綜合征的風(fēng)險。TCR和CAR-NK療法都可以使用與CAR-T細(xì)胞相似的體外和體內(nèi)方法進(jìn)行評估，以確保其療效和安全性得到充分評估。

腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）

腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）:TILs是直接從患者的腫瘤組織中獲取的。從提取的腫瘤中分離出來后，培養(yǎng)TILs以顯著增加其數(shù)量，然后重新引入患者體內(nèi)。

在細(xì)胞免疫療法的個性化基礎(chǔ)上，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）為癌癥治療提供了另一片新天地。這些直接從患者腫瘤中分離出來的細(xì)胞，天生擅長識別癌細(xì)胞，這意味著它們不需要像CAR-T細(xì)胞那樣的基因工程改造。然而，與CAR-T細(xì)胞一樣，它們也會被擴(kuò)增到數(shù)百萬，并重新輸注以增強(qiáng)對腫瘤的免疫反應(yīng)。鑒于FDA對全面免疫反應(yīng)評估的重視，像ELISpot和FluoroSpot這樣的細(xì)胞因子分泌檢測方法非常適合用于檢測分離出的TILs的功能性、活性和效力。

那么，ELISpot或FluoroSpot如何用于監(jiān)測TILs在生產(chǎn)過程中的效力呢？TIL研究人員在評估TILs效力時，主要想解答三個問題。首先，分離出的TILs是否能夠被激活以對抗自體腫瘤。在這里，培養(yǎng)的TILs會暴露于癌細(xì)胞中，并通過ELISpot或與FluoroSpot（IFN-γ、顆粒酶B、穿孔素、IL-2或TNF-α）多重檢測來捕獲能夠殺死靶細(xì)胞的相關(guān)細(xì)胞因子和分析物，從而檢測它們的反應(yīng)。Mabtech開發(fā)了一種非常適合評估TIL產(chǎn)品的FluoroSpot試劑盒(貨號FSP-013609-TD-2)：FluoroSpot Path：人類免疫療法效力（3色）。其次，需要評估TILs在快速擴(kuò)增（REP）或大規(guī)模培養(yǎng)過程后的組成變化。來自這兩種生產(chǎn)策略的細(xì)胞會用腫瘤相關(guān)肽刺激，并通過ELISpot或FluoroSpot評估它們的反應(yīng)性分泌特征。最后，與CAR-T細(xì)胞一樣，使用MAT檢測策略（IL-6 ELISA、IL-1b ELISA、IL-6/IL-1b FluoroSpot）進(jìn)行熱原檢測也是必不可少的。

TILs的功能可以通過FluoroSpot進(jìn)行評估，方法是直接用表達(dá)腫瘤特異性抗原（TSA）的自體癌細(xì)胞或TSA肽池來刺激這些細(xì)胞。功能正常的細(xì)胞會分泌感興趣的分析物（IFN-γ、顆粒酶B、穿孔素、IL-2或TNF-α），這些分析物可以用FluoroSpot檢測到。

癌癥疫苗

癌癥疫苗：研究人員收集測序數(shù)據(jù)以識別潛在的腫瘤特異性抗原（TSAs），這些抗原隨后被用于制造病毒載體、肽或DNA/RNA基礎(chǔ)的疫苗，并將這些疫苗提供給患者以引發(fā)針對癌癥的特異性免疫反應(yīng)。

癌癥疫苗旨在激發(fā)針對腫瘤的強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，并為新型癌癥治療鋪平了道路。這些疫苗有多種形式：核酸疫苗，利用DNA或RNA，指示患者的細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤抗原，從而引發(fā)針對性的免疫反應(yīng)；細(xì)胞疫苗引導(dǎo)免疫反應(yīng)針對癌細(xì)胞抗原；病毒疫苗利用改造后的病毒遞送癌癥抗原；肽疫苗利用癌細(xì)胞中的短蛋白序列來刺激免疫反應(yīng)。

我們之前在其他療法中提到過腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）和腫瘤特異性抗原（TSAs）作為潛在靶點(diǎn)，癌癥疫苗也不例外。然而，由于TSAs具有更高的免疫原性，并且它們不存在于健康組織中，從而避免了不必要的組織損傷，因此出現(xiàn)了向TSAs轉(zhuǎn)變的趨勢。這些癌癥疫苗標(biāo)志著一種多維度刺激人體防御機(jī)制的方法，開啟了抗擊癌癥的新紀(jì)元。每種疫苗類型在開發(fā)和評估過程中都有其獨(dú)特的挑戰(zhàn)，其中像ELISpot和FluoroSpot檢測這樣的敏感工具在評估它們的療效和塑造其治療潛力方面具有不可估量的價值。通過ELISpot和FluoroSpot檢測，可以簡化對患者體內(nèi)強(qiáng)大且具有癌癥特異性的免疫反應(yīng)的評估。在疫苗接種前以及接種后（包括加強(qiáng)針）收集的PBMC樣本可以直接進(jìn)行分析，或者在分選為CD8或CD4 T細(xì)胞亞群后再進(jìn)行分析。當(dāng)這些細(xì)胞受到TSA衍生肽池的刺激時，它們會通過分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2、顆粒酶B和穿孔素來揭示關(guān)鍵的免疫反應(yīng)，而這些反應(yīng)可以通過這些檢測方法輕松測量。為什么不試試Mabtech專門設(shè)計用于評估與疫苗誘導(dǎo)反應(yīng)相關(guān)的重要的分析物分泌的FluoroSpot Path：人類免疫監(jiān)測（3色）試劑盒(貨號FSP-010209-TD-2)呢？

可以用TSA衍生的肽池刺激分離的pbmc，以測量癌癥疫苗誘導(dǎo)的癌癥特異性T細(xì)胞反應(yīng)。

利用病毒載體進(jìn)行基因治療

利用病毒載體進(jìn)行基因治療：基于病毒載體的基因治療首先設(shè)計一個包含缺失或缺陷基因的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒。然后制備包含轉(zhuǎn)基因的病毒載體，并將其給予患者以恢復(fù)特定蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和正常功能。

基因療法是用于對抗遺傳性或復(fù)雜疾病的創(chuàng)新策略。其目標(biāo)是通過基因校正、基因替換或增強(qiáng)，或基因沉默來替換突變或缺失的基因。這里我們將重點(diǎn)介紹體內(nèi)療法，即通過病毒載體將感興趣的基因傳遞給患者。腺相關(guān)病毒（AAV）基因療法是目前最常用的病毒載體基因療法。這些療法利用經(jīng)過改造的非致病性AAV載體，因其靶向精準(zhǔn)和穩(wěn)定的基因傳遞而受到青睞。AAV基因療法引入功能性基因（稱為轉(zhuǎn)基因），以補(bǔ)償有缺陷或缺失的基因，從而有望從根本上糾正疾病。目前已有幾種獲得FDA批準(zhǔn)的AAV療法，它們在遺傳醫(yī)學(xué)領(lǐng)域樹立了先例，為治愈曾經(jīng)被認(rèn)為是終生挑戰(zhàn)的遺傳性疾病打開了大門。免疫反應(yīng)評估的作用變得越來越重要，而ELISpot和FluoroSpot檢測為了解免疫系統(tǒng)與這些新型治療藥物的相互作用提供了關(guān)鍵策略。傳統(tǒng)上，對AAV基因療法的免疫反應(yīng)檢測主要集中在通過IgG ELISA試劑盒或中和試驗(yàn)檢測針對AAV或轉(zhuǎn)基因蛋白的特異性抗體。然而，評估T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)同樣重要，并且可以提供額外的重要免疫見解。通過使用來自AAV載體和轉(zhuǎn)基因的肽池分析治療前后的PBMC樣本，ELISpot和FluoroSpot檢測可以對細(xì)胞免疫反應(yīng)進(jìn)行敏感且穩(wěn)健的評估。理想情況下，對于成功的療法，人們希望在針對IFN-γ、TNF-α、IL-2和顆粒酶B的檢測中，幾乎或根本沒有斑點(diǎn)形成。此外，還可以定量檢測先天免疫反應(yīng)，如I型干擾素分泌（IFN-α或IFN-β），從而提供免疫系統(tǒng)與療法相互作用的全面概況。

在AAV基因治療之前和之后可以分離免疫細(xì)胞，使用AAV或轉(zhuǎn)基因衍生的肽池來評估它們的免疫原性。此外，還會測試對AAV和轉(zhuǎn)基因本身的先天反應(yīng)，特別是漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDCs）和其他I型干擾素反應(yīng)的先天驅(qū)動因素。

檢查點(diǎn)阻斷抑制劑

檢查點(diǎn)抑制劑是一種免疫療法，通過阻斷抑制免疫系統(tǒng)有效攻擊癌細(xì)胞的蛋白發(fā)揮作用。這些療法通常被歸類為單克隆抗體和靶向治療，因?yàn)樗鼈兛梢灾苯影邢蛱囟ǖ拿庖邫z查點(diǎn)，如PD-1或CTLA-4，這些檢查點(diǎn)負(fù)責(zé)抑制免疫反應(yīng)。ELISpot和FluoroSpot檢測是評估檢查點(diǎn)抑制劑療效的關(guān)鍵工具。通過檢測細(xì)胞因子分泌，如IFN-γ或TNF-α，這些檢測可以直接證明T細(xì)胞在檢查點(diǎn)阻斷療法下的活性增強(qiáng)。FluoroSpot能夠同時檢測多種細(xì)胞因子，可以進(jìn)一步表征由檢查點(diǎn)抑制劑激活的T細(xì)胞的多功能性，從而更全面地理解免疫反應(yīng)。這種免疫監(jiān)測對于在臨床前和臨床環(huán)境中評估檢查點(diǎn)抑制劑的效力和作用機(jī)制至關(guān)重要。

希望通過以上內(nèi)容能夠展示ELISpot和FluoroSpot在不同細(xì)胞與基因治療（CGTs）的開發(fā)和評估中不可或缺的作用。這些檢測可以提供深入的免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)，對于推進(jìn)臨床試驗(yàn)和促進(jìn)新興療法的成功至關(guān)重要。

***以上均為人的ELISpot和FluoroSpot試劑盒，其他種屬的ELISpot和FluoroSpot試劑盒，詳詢艾美捷科技