補體活性的測定用于識別補體系統(tǒng)是否在體內(nèi)受到影響，并在補體治療時代用于監(jiān)測和篩選補體抑制劑的功能。歷史上使用的溶血試驗由于調(diào)理作用、紅細胞的穩(wěn)定性以及復(fù)雜的耗時步驟難以標(biāo)準(zhǔn)化。基于ELISA的試驗可以克服這一點，但可能會受到高血清稀釋度和限制性定量的阻礙。替代途徑（AP）補體活性試驗（貨號HK3012）已經(jīng)開發(fā)出來，旨在通過準(zhǔn)確、更標(biāo)準(zhǔn)化和高通量的補體活性評估來改進功能性補體測量。

人替代途徑補體活性試驗（貨號HK3012）在體外測量血清中的補體功能。試驗的孔用脂多糖（LPS）包被，當(dāng)補體級聯(lián)反應(yīng)完成后，通過C9新表位抗體檢測體外形成的膜攻擊復(fù)合物（MAC）復(fù)合物。

功能替代途徑檢測的示意圖：

補體激活的定量分析:

(a-d) 對經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換的吸光度（OD）值進行回歸分析。通路活性以校準(zhǔn)品活性的百分比表示。  

(a) 校準(zhǔn)血清和供體血清的OD值。  

(b) 確定最大OD值，并省略具有相似OD值或更高OD值的稀釋度。  

(c) 將OD值轉(zhuǎn)換到0和1之間，隨后使用公式y(tǒng)’=ln[y/(1-y)]對值進行對數(shù)轉(zhuǎn)換。  

(d) 對數(shù)據(jù)點應(yīng)用線性回歸分析。

最佳樣本稀釋與定量：

最佳血清稀釋度是通過測試不同血清供體的關(guān)鍵點稀釋度來確定的。在關(guān)鍵點稀釋度（7.5倍，見上圖）時，所有補體成分均不受限制，且替代途徑的活性達到100%。超過關(guān)鍵點的稀釋度可用于定量測量樣本的補體活性，與由保存的混合血清組成的校準(zhǔn)品進行比較。如果出現(xiàn)異常活性水平，只要關(guān)鍵點稀釋度已經(jīng)驗證，可以測試其他稀釋度。

結(jié)論：

通過對100名健康血清供體的隊列研究發(fā)現(xiàn)，替代途徑活性呈正態(tài)分布（見下圖）。大多數(shù)供體的通路活性與校準(zhǔn)品相比為100%-200%。

Hycult Biotech開發(fā)了一種易于使用且標(biāo)準(zhǔn)化的替代途徑補體活性檢測方法（貨號HK3012），能夠?qū)崿F(xiàn)可重復(fù)且定量的補體檢測，用于篩選補體治療藥物。該檢測方法能夠在低血清稀釋度（7.5倍至38倍稀釋）下測量補體活性，從而降低假陰性結(jié)果的可能性。

樣本處理：

對四種不同樣本的臺面穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性進行了測定。如果替代途徑（AP）活性的回收率在80%-120%之間，則認(rèn)為樣本是穩(wěn)定的。樣本在室溫下放置16小時或在冰上過夜（O/N）后仍保持穩(wěn)定。此外，樣本在經(jīng)過四次凍融循環(huán)后也保持穩(wěn)定。盡管如此，仍建議盡量減少凍融循環(huán)次數(shù)，并將樣本保存在冰上，以防止補體激活。

批內(nèi)和批間差異：

通過在12次實驗中使用三個相同的樣本對試驗的可重復(fù)性進行了測試。批內(nèi)變異和批間變異分別滿足變異系數(shù)（CV%）小于15%和小于20%的要求（見下表），這意味著替代途徑（AP）試驗是可重復(fù)的。

孵育溫度和時間的影響：

通過增加和減少孵育溫度和時間來評估試驗的穩(wěn)健性。在40℃孵育時可以獲得更高的信號，而降低孵育溫度則會完全阻止通路激活（見下圖）。補體級聯(lián)反應(yīng)依賴于酶活性和復(fù)合物的形成，這些在37℃時最為理想。縮短試驗流程也是不建議的，因為這會導(dǎo)致補體活性顯著降低。

抑制劑檢測：

替代途徑（AP）試驗的一個應(yīng)用是測試補體抑制劑的效力。一種針對AP特異性的C3抑制劑在AP試驗中進行了測試。隨著抑制劑濃度的增加，觀察到補體活性降低，最終導(dǎo)致替代途徑活性完全被阻斷。結(jié)果（見上圖）證實了AP試驗適用于篩選新的補體抑制劑。

AP的激活涉及C3的自發(fā)水解，與B因子結(jié)合形成C3(H2O)Bb轉(zhuǎn)化酶，該轉(zhuǎn)化酶可以通過補體因子P（properdin）穩(wěn)定。調(diào)節(jié)則由因子H（fH）和因子I（fI）等蛋白完成。所有途徑均產(chǎn)生C3轉(zhuǎn)化酶，將C3分解為主要片段C3b。這些途徑在C3b啟動第二個轉(zhuǎn)化酶——C5轉(zhuǎn)化酶時匯聚，C5轉(zhuǎn)化酶將C5分解為C5a和C5b，放大補體活性并形成細胞溶解性的膜攻擊復(fù)合物（MAC）。

補體蛋白評估或補體活性檢測有助于識別體內(nèi)補體系統(tǒng)的異常，并篩選補體抑制劑的功能。傳統(tǒng)上使用的溶血試驗由于調(diào)理作用和紅細胞穩(wěn)定性等復(fù)雜因素，難以標(biāo)準(zhǔn)化。基于ELISA的檢測方法雖然更具靈活性，但受到血清稀釋的挑戰(zhàn)。HK3012替代補體途徑活性檢測方法解決了這些問題，提供了一種標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方法。隨著補體抑制劑成本的增加以及對更有效選項的需求，準(zhǔn)確測量補體活性變得至關(guān)重要。

HK3012替代補體途徑活性檢測方法通過使用脂多糖（LPS）包被的孔來檢測體外形成的膜攻擊復(fù)合物（MAC）復(fù)合物，使用C9新表位抗體進行檢測，從而在體外評估補體功能。該檢測從7.5倍的血清稀釋開始，并使用特定緩沖液防止不同途徑之間的干擾。通過1.5倍稀釋結(jié)合回歸分析，能夠準(zhǔn)確測量補體活性和抑制能力。