引言

細胞侵襲是一個重要的生理現(xiàn)象，不僅在胚胎發(fā)育、免疫過程和傷口愈合中起著關鍵作用，也對癌細胞的轉移至關重要。研究細胞侵襲的實驗通常使用傳統(tǒng)的侵襲實驗，但基于動物的ECM存在挑戰(zhàn)。VitroGel 水凝膠是一種合成的無動物源水凝膠，具有可調(diào)生物物理和生化特性，為細胞遷移研究提供了便利并支持高通量操作。VitroGel已在乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤等細胞侵襲實驗中得到成功應用，為細胞侵襲和運動研究提供了強大工具。

基于 VitroGel 的細胞侵襲實驗試劑盒評估高度侵襲性的膠質母細胞瘤細胞 U87-MG 的侵襲性，包括“即用型”和可調(diào)諧的“高濃度”試劑盒，研究了水凝膠機械強度和功能配體對細胞侵襲的影響，還描述了一種新穎獨特的使用該試劑盒創(chuàng)建的侵襲實驗，能將趨化因子和藥理試劑嵌入基質以評估趨化作用。

材料和方法

細胞培養(yǎng)

U87-MG膠質母細胞瘤細胞在補充有10％胎牛血清（FBS）、1％青霉素-鏈霉素和1％谷氨酰胺的最低必需培養(yǎng)基（MEM 1X）中培養(yǎng)。當細胞達到80-90％匯合時進行傳代。

細胞侵襲實驗試劑盒：

即用型，細胞侵襲實驗試劑盒：

VitroGel細胞侵襲試劑盒（Cat#IA-VHM01-1P）

可調(diào)節(jié)，高濃度細胞侵襲實驗試劑盒：

VitroGel 3D細胞侵襲試劑盒（Cat#IA-HC001-1P）

VitroGel RGD細胞侵襲試劑盒（Cat#IA-HC003-1P）

VitroGel MMP細胞侵襲試劑盒（Cat#IA-HC010-1P）

細胞侵襲的其他材料

1X磷酸鹽緩沖鹽水（1XPBS）

4％甲醛

臺盼藍染色劑

棉簽

鑷子

甲醇

結晶紫染色劑

微量移液器和低保留移液器吸頭

Zeiss顯微鏡

Image J軟件

方法

1. VitroGel 細胞侵襲實驗試劑盒（即用型）

1) 使VitroGel水凝膠基質和培養(yǎng)基達到室溫。

2) 向500μL基礎細胞培養(yǎng)基中加入1mL VitroGel水凝膠基質溶液，并輕輕吹打5-10次以均勻混合混合物。（保持VitroGel水凝膠基質溶液和基礎細胞培養(yǎng)基的2:1體積比混合）。*如果使用低鹽濃度的細胞培養(yǎng)基，例如RMPI 1640培養(yǎng)基，請考慮使用1:1體積比混合。（例如，將500μL VitroGel水凝膠溶液與500μL細胞培養(yǎng)基混合）。注意：如果需要向水凝膠基質中添加補充劑，如細胞因子、生長因子、趨化因子或化學試劑，請將補充劑的3倍所需濃度添加到細胞培養(yǎng)基中。然后可以將細胞培養(yǎng)基與VitroGel水凝膠溶液混合，以使水凝膠基質中的最終補充劑濃度為1X。（例如：制備含有30ng/mL細胞因子的培養(yǎng)基。將VitroGel水凝膠基質溶液與培養(yǎng)基以2:1體積比混合，以獲得水凝膠基質內(nèi)10ng/mL細胞因子的最終濃度）。

3) 向每個插入物中加入100μL水凝膠混合物，并確保每個插入物表面均勻分布有水凝膠。注意：如果實驗需要更薄的凝膠來評估侵襲，請將每個插入物的水凝膠體積調(diào)整為50-100μL。

4) 在室溫下讓水凝膠混合物固化20分鐘，然后在水凝膠頂部加入細胞。

5) 在所需的培養(yǎng)基（即無血清培養(yǎng)基）中制備細胞懸液，濃度為1-3 x 10*5細胞/mL，并在水凝膠頂部加入100μL細胞懸液。可選的接種方法：為確保細胞接種在水凝膠表面，首先在水凝膠頂部加入50％的培養(yǎng)基（無細胞）。等待5-10分鐘，然后在水凝膠頂部加入剩余50％的含有細胞的培養(yǎng)基。（例如，首先加入50μL培養(yǎng)基（無細胞）；等待10-5分鐘；然后在頂部加入50μl含有2-6 x 10*6細胞/mL的培養(yǎng)基）。

6) 制備含有感興趣因素（即趨化因子、細胞因子或血清）的細胞培養(yǎng)基，并向外孔中加入500μL細胞培養(yǎng)基。

7) 將細胞在濕潤的細胞培養(yǎng)箱中于37°C下孵育。

2. 可調(diào)節(jié)，高濃度細胞侵襲實驗試劑盒

以下協(xié)議適用于所有VitroGel高濃度細胞侵襲實驗試劑盒版本。下面以VitroGel RGD細胞侵襲實驗試劑盒為例。

1) 使VitroGel RGD水凝膠和基礎培養(yǎng)基達到室溫。

2) 用VitroGel 稀釋溶液將VitroGel RGD水凝膠溶液稀釋至所需濃度。參考表1獲取不同比例的推薦體積。

表1：高濃度水凝膠不同稀釋比例的VitroGel水凝膠溶液、稀釋溶液和細胞培養(yǎng)基的體積。

3) 將稀釋后的水凝膠溶液與基礎培養(yǎng)基以4:1的比例混合。參考表1以獲取混合的建議體積。提示：如果您需要向水凝膠基質中添加細胞因子、生長因子、趨化因子或化學試劑等補充劑，將5倍濃度的補充劑加入細胞培養(yǎng)基中。然后可以將細胞培養(yǎng)基與稀釋的VitroGel水凝膠溶液以4:1的比例混合，以在水凝膠基質中獲得1倍的最終補充濃度。（例如：準備含有50 ng/mL細胞因子的培養(yǎng)基。將稀釋后的VitroGel水凝膠溶液與培養(yǎng)基以4:1的體積/體積混合比混合，以在水凝膠基質中獲得10 ng/mL細胞因子的最終濃度）

4) 向每個插入物中加入 100μL 水凝膠混合物，并確保每個插入物表面均勻覆蓋有水凝膠。

注意：如果實驗需要更薄的凝膠來評估侵襲，請將每個插入物的水凝膠體積調(diào)整為 50-100μL。

5) 在室溫下讓水凝膠混合物固化 20 分鐘，然后在水凝膠頂部加入細胞。

6) 在所需的培養(yǎng)基（即無血清培養(yǎng)基）中制備細胞懸液，濃度為 1-3 x 10*5 細胞/mL，并在水凝膠頂部加入 100μL 細胞懸液。

可選的接種方法：為確保細胞接種在水凝膠表面，首先在水凝膠頂部加入 50％的培養(yǎng)基（無細胞）。等待 5-10 分鐘，然后在水凝膠頂部加入剩余 50％的含有細胞的培養(yǎng)基。（例如，首先加入 50μL 培養(yǎng)基（無細胞）；等待 10-5 分鐘；然后在頂部加入 50μl 含有 2-6 x 10*6 細胞/mL 的培養(yǎng)基）。

7) 制備含有感興趣因素（即趨化因子、細胞因子或血清）的細胞培養(yǎng)基，并向外孔中加入 500μL 細胞培養(yǎng)基。

8) 將細胞在濕潤的細胞培養(yǎng)箱中于 37°C 下孵育。

閱讀完整的協(xié)議請點擊這里：https://www.thewellbio.com/product/vitrogel-cell-invasion-assay-kit/

結果

1. VitroGel 細胞侵襲實驗試劑盒（即用型）

U87-MG 膠質母細胞瘤細胞向血清梯度的侵襲

即用型水凝膠-細胞侵襲實驗試劑盒：

VitroGel 細胞侵襲實驗試劑盒（CAT #IA-VHM01-1P）

插入物：VitroGel 水凝膠基質與 MEM 基礎培養(yǎng)基以 2:1 的體積比混合

外孔：MEM 基礎培養(yǎng)基（無血清）或 MEM 含 20％FBS

細胞：U87-MG 細胞（每個插入物 3.8 x 10*4 細胞）

細胞孵育時間：48 小時

為了進行傳統(tǒng)的侵襲實驗，將 VitroGel 水凝膠基質與 MEM 基礎培養(yǎng)基以 2:1 的體積比混合。將水凝膠混合物（100μL）加入每個插入物中，然后在室溫下孵育 20 分鐘以使水凝膠固化。然后將 U87-MG 細胞（每個插入物 3.8 x 10*4 細胞）重懸于 MEM 基礎培養(yǎng)基中，并放置在涂層插入物的頂部。向外孔中補充 MEM 基礎培養(yǎng)基或補充有 20％FBS 的 MEM 培養(yǎng)基（每孔 500μL，圖 1A）。將培養(yǎng)物在 37°C 下孵育 48 小時。在細胞孵育后，我們進行了結晶紫染色以可視化細胞侵襲（圖 1B-C）。

正如預期的那樣，與在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞相比，暴露于補充有 20％FBS 的培養(yǎng)基中的 U87-MG 細胞顯著侵襲了水凝膠基質（圖 1B-C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，VitroGel 細胞侵襲實驗試劑盒是一種可行的工具，可用于檢查由血清梯度引起的細胞侵襲。

圖 1. U87-MG 膠質母細胞瘤細胞通過 VitroGel 水凝膠基質的侵襲由血清梯度引起。

A. 展示侵襲實驗細胞培養(yǎng)設置的示意圖。B. 通過進行結晶紫染色，然后進行光學顯微鏡觀察，可視化 U-87MG 細胞侵襲。圖像顯示了對照組（無 FBS）和 20％FBS 條件下的膜插入物。使用 Zeiss 顯微鏡在 10X 放大倍數(shù)下獲得圖像。C. 對照組和 20％FBS 組之間 U87-MG 細胞侵襲的倍數(shù)變化。將對照組歸一化為 1。星號（*）表示 p<0.05。

通過將細胞因子或趨化因子嵌入 VitroGel 水凝膠基質中來評估細胞侵襲

即用型水凝膠-細胞侵襲實驗試劑盒：

VitroGel 細胞侵襲實驗試劑盒（CAT #IA-VHM01-1P）

插入物：VitroGel 水凝膠基質與 MEM 基礎培養(yǎng)基混合，有或無 TGF-β1

外孔：MEM 基礎培養(yǎng)基（無血清）或 MEM 含 20％FBS

細胞：U87-MG 細胞（每個插入物 3 x 10*4 細胞）

細胞孵育時間：24 小時

傳統(tǒng)的侵襲實驗經(jīng)常用于檢查細胞向位于外孔中的趨化因子或細胞因子的侵襲。我們通過將細胞因子，轉化生長因子（TGF）-β1 嵌入水凝膠中而不是將其放置在外孔中來適應這種方法。此外，將 VitroGel 水凝膠基質與補充有 TGF-β1（30ng/mL）的 MEM 基礎培養(yǎng)基或與 MEM 基礎培養(yǎng)基以 2:1 的比例混合（圖 2A）。將水凝膠混合物（100μL）均勻地加入插入物中，并在室溫下固化 20 分鐘。然后將細胞（3 x 10*4 ）添加到水凝膠頂部，并向外孔中填充 MEM 基礎培養(yǎng)基或含有 20％FBS 的 MEM。將培養(yǎng)物在 37°C 下孵育 48 小時，然后進行結晶紫染色以評估細胞侵襲。

為了確定細胞侵襲是否是由于 TGF-β1 而不是由于外孔中的 FBS 引起的，我們建立了一個對照組，其中水凝膠未補充 TGF-β1，但外孔中含有 20％FBS（圖 2A）。我們觀察到增強的外孔，這與圖 1B 和 1C 中顯示的結果一致。然而，與外孔中含有無血清培養(yǎng)基或含 FBS 的培養(yǎng)基的細胞相比，將 TGF-β1 添加到水凝膠中增加了 U87-MG 細胞通過水凝膠的侵襲（圖 2B-C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，將細胞因子或趨化因子嵌入 VitroGel 水凝膠中是一個很好的平臺，可以更好地評估趨化作用。

圖 2. TGF-β1 在 VitroGel 水凝膠基質內(nèi)誘導 U87-MG 膠質母細胞瘤細胞的侵襲。

A. 展示侵襲實驗設置的可視化表示。B. 光學顯微鏡圖像顯示在不同組中進行結晶紫染色后的細胞侵襲。使用 Zeiss 顯微鏡在 10X 放大倍數(shù)下獲得圖像。C. 每個實驗條件下 U87-MG 細胞侵襲的平均值。

2. VitroGel 高濃度細胞侵襲實驗試劑盒（可調(diào)節(jié)）

不同水凝膠機械強度對 U87-MG 膠質母細胞瘤細胞侵襲的影響

可調(diào)諧水凝膠-高濃度細胞侵襲實驗試劑盒：

VitroGel RGD 細胞侵襲實驗試劑盒（CAT #IA-HC003-1P）

插入物：VitroGel RGD 水凝膠以 1:1、1:3 和 1:5 稀釋比例

外孔：MEM 基礎培養(yǎng)基（無血清）或 MEM 含 20％FBS

細胞：U87-MG 細胞（每個插入物 3 x 10*4 細胞）

細胞孵育時間：24 小時

VitroGel 高濃度水凝膠的獨特性質是，其機械強度可以通過使用 VitroGel 稀釋溶液進行調(diào)整，以適應不同的體外和體內(nèi)方法。根據(jù)稀釋比例，VitroGel 高濃度水凝膠可以實現(xiàn) 10-4000Pa 的機械強度（彈性模量）。因此，調(diào)節(jié) VitroGel 高濃度水凝膠的機械強度是一種可以適應并應用于傳統(tǒng)侵襲實驗的方法。

評估水凝膠的力學強度是否影響細胞侵襲，我們使用以下比例將VitroGel RGD與VitroGel稀釋液稀釋: 1:1、1:3和1:5（圖3A）。 水凝膠混合物加入到插入物中，在室溫下孵育20分鐘，懸浮在無血清培養(yǎng)基中的U87-MG膠質母細胞瘤細胞放置在插入物頂部。 外部孔用無血清培養(yǎng)基或含有20% FBS的培養(yǎng)基覆蓋。 然后，細胞在37°C下孵育24小時，隨后使用結晶紫染色檢查細胞侵襲。

研究結果顯示，增加VitroGel RGD的稀釋比允許細胞侵入水凝膠基質，當化學引誘物，如含有血清的培養(yǎng)基放置在外部孔時（圖3 B-C）。 具體地，我們證明VitroGel RGD與VitroGel稀釋液的1:5稀釋對水凝膠基質的細胞侵襲最高，其次是1:3和1:1的稀釋比（圖3 B-C）。 這些發(fā)現(xiàn)表明，調(diào)整VitroGel RGD的力學強度會影響細胞對FBS梯度的運動能力。

圖 3. 使用 VitroGel RGD 高濃度水凝膠對 U87-MG 膠質母細胞瘤（GBM）細胞的侵襲。

A. 實驗設置的示意圖。B. 顯微鏡圖像顯示 U87-MG 膠質母細胞瘤細胞通過 VitroGel RGD 的侵襲。將水凝膠用 VitroGel 稀釋溶液以 1:1、1:3 和 1:5 的比例稀釋。使用 Zeiss 顯微鏡在 10X 放大倍數(shù)下獲得圖像。C. 對于 VitroGel RGD 的每種稀釋，F(xiàn)BS 組相對于無 FBS 組的細胞侵襲倍數(shù)變化。將無 FBS 組歸一化為 1。星號表示 p < 0.05。

向 VitroGel 高濃度水凝膠中添加細胞因子、趨化因子和生長因子以研究細胞侵襲

可調(diào)諧水凝膠-高濃度細胞侵襲實驗試劑盒：

VitroGel 3D 細胞侵襲實驗試劑盒（CAT #IA-HC001-1P）

VitroGel RGD 細胞侵襲實驗試劑盒（CAT #IA-HC003-1P）

插入物：VitroGel 3D 和 VitroGel RGD 水凝膠以 1:3 稀釋比與 TGF-β1 或無 TGF-β1

外孔：MEM 基礎培養(yǎng)基（無血清）或 MEM 含 20％FBS

細胞：U87-MG 細胞（每個插入物 3 x 10*4 細胞）

細胞孵育時間：48 小時

VitroGel 高濃度水凝膠易于使用，可針對各種實驗應用進行定制，包括傳統(tǒng)的侵襲實驗。與 VitroGel 即用型水凝膠類似，細胞因子、趨化因子或生長因子可以摻入 VitroGel 高濃度水凝膠中以測定細胞侵襲。因此，我們通過將 TGF-β1 嵌入 VitroGel 3D 和 VitroGel RGD 高濃度水凝膠中來評估 U87-MG 膠質母細胞瘤細胞對細胞因子梯度的侵襲。

為了檢查 U87-MG 膠質母細胞瘤細胞向 TGF-β1 梯度的侵襲，我們首先用 VitroGel 稀釋溶液對每種水凝膠進行 1:3 稀釋。隨后，將水凝膠混合物與 MEM 基礎培養(yǎng)基或補充有 TGF-β1（30ng/mL）的 MEM 基礎培養(yǎng)基以 4:1 的比例混合。將稀釋的水凝膠添加到插入物中，并允許固化 20 分鐘，然后將細胞懸液添加到水凝膠的頂部。在外孔中放置無血清培養(yǎng)基或補充有 20％FBS 的培養(yǎng)基。將細胞在 37°C 下孵育 48 小時。之后，通過進行結晶紫染色來評估細胞侵襲。

TGF-β1 在水凝膠中的添加刺激了 U87-MG 膠質母細胞瘤細胞的侵襲。此外，我們觀察到，與含有 TGF-β1 的 VitroGel 3D 相比，將 TGF-β1 嵌入 VitroGel RGD 中有利于細胞侵襲。與圖 3B 和 3C 中的發(fā)現(xiàn)一致，我們表明，在外孔中含有血清的培養(yǎng)基促進了水凝膠中不含 TGF-β1 的組中的細胞侵襲。總之，結果表明，細胞因子、趨化因子或生長因子可以摻入 VitroGel 高濃度水凝膠中以評估細胞侵襲。

圖 5. TGF-β1 在 VitroGel 3D 和 VitroGel RGD 中促進 U87-MG 膠質母細胞瘤細胞的侵襲。

A. 實驗設置的可視化表示。培養(yǎng)物孵育 48 小時。B. 顯微鏡圖像顯示 U87-MG 膠質母細胞瘤細胞通過 VitroGel 3D 和 RGD 的侵襲。每種水凝膠用 VitroGel 稀釋溶液以 1:3 的比例稀釋，然后與 MEM 基礎培養(yǎng)基或含有 TGF-β1（30ng/mL）的 MEM 以 4:1 的比例混合。使用 Zeiss 顯微鏡在 10X 放大倍數(shù)下獲得圖像。C. 對于每種水凝膠，TGF-β1 在水凝膠和 FBS 組相對于無 FBS 組的細胞侵襲倍數(shù)變化。將無 FBS 組歸一化為 1。

結論

本應用說明中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明，無論是現(xiàn)成的VitroGel 水凝膠基質，還是可調(diào)節(jié)的VitroGel “高濃度”水凝膠均可用于傳統(tǒng)的侵襲試驗。

VitroGel水凝膠基質是研究人員的絕佳選擇，其實驗不需要調(diào)整水凝膠的力學強度或特定的生物功能配體來研究細胞侵襲。相反，VitroGel高濃度水凝膠是可調(diào)節(jié)的；因此，當與VitroGel稀釋液結合時，彈性模量的力學強度可調(diào)整至4000帕。我們的研究結果顯示，增加高濃度VitroGel水凝膠（VitroGel RGD與VitroGel稀釋液）的稀釋比增強了膠質母細胞瘤細胞的侵襲，表明力學強度影響細胞侵襲。此外，VitroGel高濃度水凝膠帶有特定的生物功能配體，如MMPs、RGD等，允許評估這些因素在細胞侵襲中的作用。這項研究表明，水凝膠中的生物功能配體影響膠質母細胞瘤細胞的侵襲。

正如先前提到的，可與現(xiàn)成的VitroGel 細胞侵襲試劑盒和可調(diào)節(jié)的VitroGel 高濃度細胞侵襲試劑盒一起使用的新穎而獨特的應用是添加細胞因子、趨化因子、生長因子或藥理劑。因此，我們采用了這種方法來評估膠質母細胞瘤細胞對水凝膠內(nèi)TGF-β1梯度的侵襲。我們的研究結果表明，水凝膠中的TGF-β1刺激了膠質母細胞瘤細胞的侵襲，從而證明了在VitroGel水凝膠中結合因子是評估趨化作用的強大方法。總的來說，基于VitroGel的細胞侵襲試劑盒構成了一個功能強大且靈活的系統(tǒng)，可適用于各種侵襲試驗應用場景。

鏈接到使用的產(chǎn)品

細胞侵襲實驗試劑盒：

即用型，細胞侵襲實驗試劑盒：

VitroGel細胞侵襲試劑盒（Cat#IA-VHM01-1P）

可調(diào)節(jié)，高濃度細胞侵襲實驗試劑盒：

VitroGel 3D細胞侵襲試劑盒（Cat#IA-HC001-1P）

VitroGel RGD細胞侵襲試劑盒（Cat#IA-HC003-1P）

VitroGel MMP細胞侵襲試劑盒（Cat#IA-HC010-1P）

參考文獻

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